柱前衍生化RP-HPLC法测定胆香鼻炎片中猪去氧胆酸的含量

万朝雷，魏玲，方艺霖，黄萍，沈素芳，章超（.江西九江市第一人民医院药剂科，九江市33000；.四川乐山市食品药品检验所，乐山市 64000）

胆香鼻炎片为国家食品药品监督管理局标准收载品种（YBZ20252005），由猪胆汁膏、广藿香、白芷等9味中药制备而成，具有消炎清热、祛风散寒、通窍止痛的功效，主要用于慢性单纯性鼻炎和过敏性鼻炎的治疗。组方中主药猪胆汁膏所含的猪去氧胆酸（Hyodeoxycholic acid）具有降血脂、镇痉、抑菌等作用[1]，是处方中的主要有效成分，但原标准中无该成分的含量测定项目。由于猪去氧胆酸结构中没有紫外吸收基团，如能够在紫外检测器中检测必须经过衍生化，因此本文以1-溴乙酰基对硝基苯为衍生化试剂、18-冠醚-6为催化剂，采用柱前衍生化反相高效液相色谱（RP-HPLC）法对胆香鼻炎片中猪去氧胆酸含量进行测定，建立了较为完善的测定方法。

1 仪器与试药

2695型HPLC仪、2487紫外检测器（美国Waters公司）；XS205型电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

猪去氧胆酸对照品（中国药品生物制品检定所，批号：10087-200610）；胆香鼻炎片（吉林省大峻药业股份有限公司，批号：20090808、20091003、20091216）；乙腈（上海陆都化学试剂厂，色谱纯）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取猪去氧胆酸对照品10.51 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品贮备液。再精密量取对照品贮备液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液及阴性对照溶液的制备

取胆香鼻炎片样品，除去糖衣，研细，取约1.0 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入甲醇100 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液2 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

取处方量药材（不加入猪胆汁膏），按供试品溶液制备方法制得缺猪去氧胆酸的阴性对照溶液。

2.3 样品的衍生化

精密量取供试品溶液5 mL，置10 mL量瓶中，加氢氧化钾溶液500 μL，水浴蒸干，放冷，加18-冠醚-6和1-溴乙酰基对硝基苯试液各500 μL，密塞，放入60℃烘箱中加热60 min，取出，冷却至室温，加乙腈定容至5 mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μ m）；柱温：40 ℃；流动相：乙腈-水（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；进样量：10 μL。

2.5 系统适用性试验

取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液各适量，按“2.3”项下方法进行衍生化处理后进样。结果，供试品色谱图中有与对照品色谱图中猪去氧胆酸峰相对应的色谱峰，且该峰与其他峰的分离度＞1.5，理论板数为8 700，阴性对照无干扰。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.猪去氧胆酸对照品；B.供试品；C.阴性对照Fig1 HPLC chromatogramsA.hyodeoxycholic acid control；B.test sample；C.negative control

2.6 线性关系考察

精密量取猪去氧胆酸对照品贮备液0.5、1、2、4、8、10 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.3”项下方法进行衍生化处理后，各吸取10 μL注入液相色谱仪中进行测定。以对照品浓度（X，μg·mL-1）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y＝20 259X－13 167（r＝0.999 4，n＝6）。结果表明，猪去氧胆酸检测浓度在5.255～105.100 μg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.7 精密度试验

取猪去氧胆酸对照品溶液适量，按“2.3”项下方法进行衍生化处理后，吸取10 μL注入液相色谱仪中进行测定，连续进样6次。结果，所得峰面积平均值为423 263，RSD＝1.5%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.8 重复性试验

精密称取胆香鼻炎片样品适量，共6份，分别按“2.2”项下方法制成供试品溶液，再按“2.3”项下方法进行衍生化处理后，分别吸取10 μL注入液相色谱仪中进行测定。结果，所得峰面积平均值为443 268，RSD＝1.8%（n＝6），表明该方法重复性良好。

2.9 稳定性试验

取经衍生化处理后的供试品溶液适量，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定猪去氧胆酸的峰面积。结果，RSD＝1.0%（n＝6），表明经衍生化后的供试品溶液在室温条件下24 h内稳定，能满足含量测定要求。

2.10 加样回收率试验

取同一胆香鼻炎片样品（批号：20091003）约0.5 g，精密称定，共6份，分别加入猪去氧胆酸对照品适量，混匀，按“2.2”项下方法制成供试品溶液，再按“2.3”项下方法进行衍生化处理后进样测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

2.11 样品含量测定

取3批胆香鼻炎片样品（批号：20090808、20091003、20091216）各适量，精密称定，分别按“2.2”项下方法制成供试品溶液，再按“2.3”项下方法进行衍生化处理后照上述色谱条件测定，代入回归方程计算样品含量。结果，3批样品中猪去氧胆酸的含量依次为8.5、8.3、9.0 mg·g-1。

3 讨论

笔者参考文献方法[2～4]分别考察了衍生化试剂和催化剂的加入量（100、200、500、1 000 μL）、加入比例（1∶1、1∶2、2∶1）、反应时间（30、40、60、120 min）和反应温度（40、50、60、80 ℃）等条件，确定当衍生化试剂和催化剂加入量为500 μL、加入比例为1∶1、反应时间为60 min、反应温度为60℃时，反应最为充分。且该方法快速、准确，衍生化后的供试品溶液稳定，被测定溶液浓度与峰面积积分值有较好的线性关系，可作为胆香鼻炎片中猪去氧胆酸含量的测定方法，并可为该制剂的质量控制提供依据。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：299.

[2]杨学军，仇丽颖，钟米娜，等.RP-HPLC柱前衍生化测定熊去氧胆酸的含量[J].西南民族大学学报（自然科学版），2007，33（4）：821.

[3]暴梅佳，黎王翠，谢庆凤，等.柱前衍生化高效液相色谱法测定清开消炎片中猪去氧胆酸的含量[J].中药新药与临床药理，2010，21（2）：186.

[4]陈文琼，余敏灵，陈文秋，等.柱前衍生RP-HPLC法测定法半夏中γ-氨基丁酸的含量[J].中国药房，2008，19（12）：929.