金龙胆草总皂苷诱导Hela细胞和SPC-A1细胞凋亡的研究

刘培，周立军，苏艳芳，颜世伦（.天津大学药物科学与技术学院，天津市300072；2.河北化工医药职业技术学院，石家庄市 050026）

金龙胆草为白酒草属植物苦蒿Conyza bliniiLevl.的干燥全草，主要分布于我国西南地区，系20世纪70年代四川省发掘的民间草药，具有清热解毒、消炎祛痰、止咳平喘之功效，临床用于治疗慢性气管炎、胃肠炎、肾炎、肝炎、痢疾、口腔炎、中耳炎、风火牙痛、湿疹、痔疮、外伤出血、烫火伤及牲畜创伤[1]。金龙胆草及其制剂在1997年版《中国药典》（一部）和《四川省药品标准》中收载[2]。目前关于金龙胆草是否具有抗癌活性的报道尚未发现。本研究以宫颈癌Hela细胞和肺癌SPC-A1细胞为模型，旨在通过研究金龙胆草总皂苷对Hela细胞和SPC-A1细胞增殖的影响，探讨金龙胆草总皂苷的抗癌机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器

XD-101型倒置生物显微镜（南京江南光电股份有限公司）；SUNRISE型酶标仪（上海麦莎生物科技有限公司）；BioDoc-It 220型凝胶成像系统（美国UVP公司）。

1.2 试药

金龙胆草产于四川省凉山州，经天津大学药物科学与技术学院周立军副教授鉴定为真品；RPMI 1640培养基（美国Gibco公司）；胰蛋白酶（美国Amresco公司）；蛋白酶K、RNA酶A（RnaseA，上海生工生物工程技术服务有限公司）；羊抗兔半胱氨酰天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Caspase-3）单克隆抗体、羊抗兔α-actin单克隆抗体、羊抗兔IgG-HRP抗体（武汉博士德生物工程技术服务有限公司）。

1.3 细胞

宫颈癌细胞系Hela细胞和肺癌细胞系SPC-A1细胞，购自天津市肿瘤研究所。

2 方法

2.1 金龙胆草总皂苷的制备

按顺序进行下列步骤：（1）将经过粉粹的金龙胆草在90%无水乙醇中加热回流提取2次，每次2 h，过滤后将滤渣用55%～65%的乙醇加热回流提取2 h并过滤，将2次滤液合并，然后减压浓缩至乙醇完全挥发；（2）将上述浓缩液用蒸馏水稀释至浓度为10～20 g·100 mL-1，然后在分液漏斗中用等量乙酸乙酯萃取4次以去除杂质，并将水层减压蒸至乙酸乙酯完全挥发，之后再于分液漏斗中用等量正丁醇萃取多次，直至萃取完全，最后将合并后的正丁醇萃取液减压浓缩而得到粗皂苷；（3）将上述粗皂苷溶于水并经大孔树脂D101柱层析，然后依次用水、30%乙醇、70%乙醇和95%乙醇进行梯度洗脱，最后将70%的乙醇洗脱物减压浓缩，即可得到金龙胆草总皂苷[3]。

2.2 细胞培养

细胞以1×107个·mL-1的浓度接种于25 cm2培养瓶中，加入RPMI 1640培养液（含5%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 U·mL-1链霉素）适量，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，培养24 h后换液去除未贴壁细胞，倒置生物显微镜下每天观察细胞生长情况。将长成致密单层细胞的细胞瓶中原培养液弃去，PBS漂洗2次，加入0.25%胰酶溶液，以使充分浸润，一般消化时间为3 min，肉眼观察瓶壁半透明的细胞层，当出现细针孔空隙时，加入适量细胞培养液中和胰酶，终止消化，视试验要求传入多瓶继续培养，一般为一传二到一传四的比例[4]。

2.3 MTT法检测金龙胆草总皂苷对细胞的抑制作用

用0.25%的胰酶消化液1 mL，37℃消化细胞3 min，显微镜下观察胞质回缩、细胞间隙增大即细胞变圆后，终止消化；加入含10%胎牛血清（FBS）的培养液中和胰酶；细胞计数，将细胞稀释至2×104个·mL-1，加入96孔板中，每孔加200 μL细胞悬液；待细胞进入指数生长期加入药物；用培养基将试验组（金龙胆草总皂苷，根据提取单品的质量和分子量计算出总皂苷的分子量约为1 200）和阳性对照组（顺铂，DDP）10倍系列稀释，浓度依次为 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7mol·L-1，并做空白对照。加药分别孵育24、48、72 h后，加5 g·L-1MTT继续孵育4 h，弃培养液，每孔加入DMSO 150 μL，酶标仪490 nm波长测吸光度（A）值，计算细胞半数抑制率（IC50）。细胞抑制率（%）＝（1－试验或阳性对照组A值）/空白对照组A值×100%。试验重复3次，每个浓度设5个复孔。

2.4DNA凝胶电泳

将阳性对照组和试验组分别加入含有IC50（mol·L-1）浓度药物的培养液，空白对照组更换新鲜培养液，培养48 h后吸出培养液并用胰酶消化，离心弃上清，PBS漂洗2次，加细胞核裂解液500 μL重悬细胞，50℃水浴3 h；加0.5 mL Tris饱和酚抽提，4 ℃、6 000 r·min-1离心5 min，上清移至新离心管；加入等体积氯仿-异戊醇（24∶1）抽提，离心，上清移至新离心管；加50 μL 3 mol·L-1乙酸钠和2 mL预冷无水乙醇，上下颠倒几次混匀，可见絮状白色沉淀物。置－20℃冰箱中30 min，4℃、12 000 r·min-1离心10 min沉淀 DNA，晾至半干后，加入含5 μL Rnase A的TE缓冲液50 μL，37℃水浴30 min即可。制备1%琼脂糖凝胶电泳，DNA样品与上样缓冲液混匀上样，置1×TAE电泳缓冲液中，室温、恒流75 mA电泳1～2 h，以DNA Marker DL2 000为分子量标准，UVP凝胶成像系统观察结果。

2.5 Western Blot法[5]检测药物对Caspase-3含量的影响

将细胞传代至培养瓶中，待细胞长至80%融合时，阳性对照组和试验组分别加入含有IC50（mol·L-1）浓度药物的培养液，空白对照更换新鲜培养液，于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养48 h，PBS漂洗，加4℃预冷的细胞裂解液[1 mol·L-1Tris-HCl（pH8.0）、0.15 mol·L-1NaCl、1%TritonX-100、0.5 mmol·L-1PMSF），于冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r·min-1离心5 min。最后将离心后的上清液分装到离心管中放于－20℃保存。采用10%分离胶、4%浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜仪（400 mA，2 h）将蛋白转于PVDF膜上，用5%脱脂奶粉封闭，摇床轻摇1 h，TBST（包含Tris-Hcl缓冲液+吐温20）漂洗15 min×3次，加一抗（含兔抗鼠Caspase-3单克隆抗体和兔抗鼠α-actin单克隆抗体的5%脱脂奶粉液），4℃轻摇过夜。次日取出膜，用TBST漂洗15 min×3次，加入二抗（含羊抗兔IgG-HRP的5%脱脂奶粉液），室温轻摇1 h，TBST洗膜15 min×3次。滴加1∶1 ECL显色液于膜上，反应3 min，压片5 min，将胶片置于显影液和定影液各5 min后观察。

2.6 统计学方法

所得数据均以±s表示，采用SPSS11.50统计软件进行分析。

3 结果

3.1 形态学观察

Hela细胞和SPC-A1细胞均为上皮样细胞，呈多角形、铺路石状生长。倒置显微镜下细胞形态见图1。

图1 倒置显微镜下细胞形态A.Hela细胞；B.SPC-A1细胞Fig1 Morphology of cells observed by inverted microscopeA.Hela cells；B.SPC-A1 cells

3.2 金龙胆草总皂苷对Hela和SPC-A1细胞的抑制作用

以10-3～10-7mol·L-1浓度金龙胆草总皂苷孵育细胞24、48、72 h后，测定金龙胆草总皂苷对Hela细胞和SPC-A1细胞的生长抑制作用。细胞抑制率与药物浓度及作用时间相关。随药物浓度增加，金龙胆草总皂苷对2种细胞的抑制率增高。随作用时间延长，金龙胆草总皂苷对细胞的抑制作用越发明显。48 h时，Hela细胞的IC50＝1.25×10-5mol·L-1，SPC-A1细胞的IC50＝1.03×10-5mol·L-1。金龙胆草总皂苷对Hela、SPC-A1细胞抑制作用的影响见表1、表2。

3.3 DNA凝胶电泳分析

表1 金龙胆草总皂苷对Hela细胞抑制作用的影响（±s）Tab1 Influence of total saponins from C.blinii on Hela cell（±s）

表1 金龙胆草总皂苷对Hela细胞抑制作用的影响（±s）Tab1 Influence of total saponins from C.blinii on Hela cell（±s）

抑制率/%浓度/mol·L-1DDP 金龙胆草总皂苷10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 24 h 5.54±0.17 6.37±0.24 20.25±1.19 44.63±2.11 60.01±2.37 48 h 7.74±0.21 8.72±0.24 49.86±1.52 72.52±2.16 80.35±2.65 72 h 7.93±0.35 10.53±0.37 50.57±2.34 77.25±2.86 86.44±2.38 24 h 6.58±0.19 6.96±0.25 22.18±1.26 45.86±2.05 62.18±2.49 48 h 8.24±0.22 9.52±0.26 51.36±1.56 79.82±2.14 86.48±2.75 72 h 9.73±0.36 12.58±0.47 57.94±2.89 82.14±2.75 91.45±2.96

DNA凝胶电泳图谱呈现梯子状断裂现象是细胞凋亡的一个重要标志[6]。凋亡时限制性核酸内切酶被激活，将DNA切成50～300 kb的大分子量DNA，进一步分解成规则的180～200 bp DNA片段或它的倍数片段。结果显示，空白对照在琼脂糖凝胶电泳上显示相对分子质量很大的一条带，这是基因组DNA条带，说明没有发生凋亡，而金龙胆草总皂苷出现了凋亡的特征性DNA ladder，并且有模糊的连续条带出现，说明金龙胆草总皂苷除诱导细胞发生凋亡外，也导致少数细胞坏死。DNA琼脂糖凝胶电泳分析见图2。

表2 金龙胆草总皂苷对SPC-A1细胞抑制作用的影响（±s）Tab2 Influence of total saponins of C.blinii on SPC-A1cells（±s）

表2 金龙胆草总皂苷对SPC-A1细胞抑制作用的影响（±s）Tab2 Influence of total saponins of C.blinii on SPC-A1cells（±s）

抑制率浓度/mol·L-1DDP 金龙胆草总皂苷10-7 10-6 10-5 10-4 10-3 24 h 5.28±0.18 5.96±0.23 21.78±1.29 43.86±2.13 63.26±2.53 48 h 6.34±0.23 8.92±0.27 50.38±1.65 76.42±2.17 81.67±2.57 72 h 9.63±0.31 12.23±0.57 53.37±2.94 80.08±2.59 86.46±3.06 24 h 6.12±0.16 6.89±0.18 24.16±1.01 47.28±2.16 71.26±2.38 48 h 7.12±0.19 10.98±0.21 56.35±1.74 81.95±2.17 85.78±2.34 72 h 10.25±0.21 14.67±0.38 59.86±1.89 85.43±2.71 88.76±2.45

图2 DNA琼脂糖凝胶电泳分析A.Hela细胞；B.SPC-A1细胞；1.DDP；2.Marker；3.金龙胆草总皂苷；4.空白对照Fig2 Agarose gel electrophoresis analysis of DNAA.Hela cells；B.SPC-A1 cells；1.DDP；2.Marker；3.Total saponins of C.blinii；4.blank control

3.4 细胞内Caspase-3蛋白含量测定结果

药物作用前后Caspase-3的表达量有显著变化，Hela细胞和SPC-A1细胞Caspase-3的表达量均明显高于空白对照，进一步从蛋白水平上说明金龙胆草总皂苷能诱导细胞发生凋亡。Western blot检测金胆草总皂苷对Caspase-3表达量的影响见图3。

图3 Western blot检测金龙胆草总皂苷对Caspase-3表达量的影响A.Hela细胞；B.SPC-A1细胞Fig3 Effects of Total saponins of C.blinii on Caspase-3 deteced by Western blot assayA.Hela cells；B.SPC-A1 cells

4 讨论

金龙胆草系菊科白酒草属植物，全世界共有80余种，对其中约20种植物的化学研究表明，二萜类、黄酮类和多聚炔类化合物是白酒草属植物的特征成分。早在2000年，Su YF等[7]对金龙胆草黄酮类成分、萜类成分、皂苷类成分等进行了系统的研究。除黄酮类、二萜类化合物外，从白酒草属植物中获得的天然产物的新类型包括三萜皂苷、鞘脂化合物、γ-吡喃酮3种。近年来，对白酒草属植物化学成分的研究取得较大进展，但有关白酒草属植物化学成分生物活性的研究很少，仅有报道conyzasaponin D和conyzasaponin F对HL-60具有中等强度的细胞毒性[8]，γ-吡喃酮类化合物具有抗真菌活性[9]，黄酮luteolin、apigenin、takakin 8-O-glucuronide 对黄嘌呤氧化酶具有抑制活性等。因此，有必要系统研究白酒草属植物化学成分的生物活性，以期阐明其药用物质基础。

在肿瘤的分子生物学研究中，肿瘤的发生机制有很多，但细胞凋亡始终是学术界的研究热点。细胞凋亡又称程序性细胞死亡，凋亡是通过启动其自身遗传机制，内源性DNA内切酶的激活，而发生自动死亡的过程。各种组织的细胞凋亡都要激活Caspase家族，Caspase家族成员能迅速启动序列性酶解死亡程序并激活核酸内切酶[10]。在内源性核酸内切酶作用下，DNA进行有控降解。其中，Caspase-3是介导细胞凋亡的一类蛋白水解酶，即Caspase家族中的关键效应酶，是凋亡途径的最终执行者，可直接降解细胞内的结构蛋白和功能蛋白，引起细胞凋亡[11]。

本试验以宫颈癌Hela细胞和肺癌SPC-A1细胞为研究模型，选择临床常用的顺铂作为阳性对照，通过MTT试验、琼脂糖凝胶电泳和Western Blot试验，说明金龙胆草总皂苷可抑制癌细胞生长，并出现特征性DNA ladder，增加Caspase-3表达量，即依次从细胞水平、分子水平和蛋白水平表明金龙胆草总皂苷抑制Hela细胞和SPC-A1细胞的增殖活性是通过诱导细胞凋亡来实现的。但是，有关金龙胆草总皂苷诱导宫颈癌Hela细胞和肺癌SPC-A1细胞凋亡的具体机制尚需进一步探讨。

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