舒筋通络外用颗粒的质量标准研究

潘志文（广东佛山市药品检验所，佛山市 528000）

舒筋通络外用颗粒为佛山市顺德区龙江医院的外用制剂，处方由大黄、当归、桂枝、独活等13味药材组成，其中大黄、当归、桂枝、独活以细粉入药，其余药味用水煎煮提取，提取液浓缩后与上述细粉混匀，制成颗粒。其用温水溶解后薰洗患处，具有温经通络、祛瘀止痛之功，用于治疗跌打损伤、筋骨疼痛、关节不利。为了控制该制剂质量，笔者采用薄层色谱（TLC）法对方中大黄、当归、桂枝、独活作定性鉴别，采用高效液相色谱（HPLC）法测定主药大黄有效成分大黄素和大黄酚的含量。

1 仪器与试药

1100型HPLC仪，包括Agilent化学工作站（美国Agilent公司）；AE240电子分析天平（瑞士Mettler Toleto公司）；KQ300超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，频率：40 kHz，功率：300 W）。

大黄、当归、桂枝、独活对照药材和大黄素、大黄酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为9022-200207、9271-200110、1191-200101、0940-200205、110756-200110、110796-200311）；舒筋通络外用颗粒样品（批号：0701、0702、0703）及阴性样品均由佛山市同德区龙江医院提供；薄层层析硅胶G（化学纯，青岛海洋化工集团公司）；甲醇为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 定性鉴别

2.1 当归、桂枝、独活的TLC鉴别[1]

取本品3 g，研细，加乙醚40 mL，超声处理10 min，滤过，滤液置分液漏斗中，用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液洗涤3次，每次20 mL，洗液合并，备用，乙醚液再用水10 mL洗涤1次，挥干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液；取当归对照药材0.8 g、桂枝对照药材0.2 g、独活对照药材0.5 g，分别加乙醚30 mL，超声处理10 min，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为相应的对照药材溶液；分别取缺当归、缺桂枝、缺独活的阴性样品各3 g，按供试品溶液的制备方法制成相应的阴性对照溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述7种溶液各2 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60 ℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与当归对照药材色谱相应的位置上，显相同的亮蓝白色荧光斑点；在与桂枝对照药材色谱相应的位置上，显相同的绿色荧光斑点；在与独活对照药材色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色荧光斑点；阴性对照无干扰。当归、桂枝、独活的TLC见图1。

2.2 大黄的TLC鉴别[1]

取“2.1”项下备用之洗液适量，用1 mol·L-1盐酸溶液调节pH值至1～2，用乙醚提取3次，每次20 mL，合并提取液，挥干，残渣加无水乙醇5 mL使溶解，作为供试品溶液；取大黄对照药材0.1 g，加乙醚30 mL，超声处理10 min，滤过，滤液挥干，残渣加无水乙醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液；取缺大黄阴性样品3 g，按供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。照TLC法[1]试验，吸取上述3种溶液各5 μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）-甲酸乙酯-甲酸（15∶5∶1）的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的5个橙黄色荧光主斑点；阴性对照无干扰。大黄的TLC见图2。

图1 当归、桂枝、独活的TLC1～3.供试品；4.当归对照药材；5.桂枝对照药材；6.独活对照药材；7.缺当归阴性对照；8.缺桂枝阴性对照；9.缺独活阴性对照Fig1 TLC of Angelica sinensis，Cinnamomum cassia and A.pubescens1～3.test samples；4.Angelicae Sinensis Radix reference substance；5.Cinnamomi Ramulus reference substance；6.Angelicae Pubescentis Radix reference substance；7.negative control without A.Sinensis；8.negative control without C.cassia；9.negative control withoutA.Pubescentis

图2 大黄的TLC1～3.供试品；4.大黄对照药材；5.缺大黄阴性对照Fig2 TLC of Rhei Radix Et Rhizoma1～3.test samples；4.Rhei Radix et Rhizoma reference substance；5.negative control without Rhei Radix Et Rhizoma

3 含量测定[2]

3.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil ODS2（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

3.2 溶液的制备

3.2.1 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用甲醇补足失重，摇匀，滤过。精密量取续滤液5 mL，置烧瓶中，挥去溶剂，加8%盐酸溶液10 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加热回流1 h，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取大黄素对照品和大黄酚对照品适量，加甲醇制成每1 mL含大黄素10 μg、大黄酚25 μg的混合溶液，即得。

3.2.3 阴性对照溶液的制备 取缺大黄阴性样品适量，按“3.2.1”项下方法制备阴性对照溶液。

3.3 空白试验

取上述混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按上述色谱条件进样测定。结果，阴性对照溶液在大黄素、大黄酚对照品色谱峰相应的位置上无干扰峰。色谱见图3。

3.4 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液 1、2、5、10、20、50 μL，注入HPLC仪，按上述色谱条件测定。分别以大黄素、大黄酚进样量（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程分别为Y大黄素＝3 737.4X大黄素－1.365 9（r＝0.999 9，n＝6）、Y大黄酚＝5 224.3X大黄酚－3.870 6（r＝0.999 9，n＝6）。结果表明，大黄素、大黄酚进样量分别在0.01～0.50、0.025～1.250 μg范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

3.5 精密度试验

图3 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.大黄素；2.大黄酚Fig3 HPLC chromatogramsA.mixed control；B.test sample；C.negative control；1.emodin，2.chrysophanol

精密吸取混合对照品溶液10 μL，重复进样6次，按上述色谱条件测定。结果，大黄素、大黄酚峰面积的RSD均为0.2%（n均为6），表明仪器精密度良好。

3.6 稳定性试验

精密吸取供试品溶液，分别于0、1、2、3、4、24 h注入HPLC仪，按上述色谱条件测定。结果，大黄素峰面积的RSD＝0.2%，大黄酚峰面积的RSD＝0.1%（n均为6），表明供试品溶液在24 h内稳定。

3.7 重复性试验

精密称取同一批样品适量，共6份，按“3.2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积；另精密吸取混合对照品溶液10 μL，同法测定，外标法计算大黄素和大黄酚含量。结果，大黄素和大黄酚平均含量的RSD分别为1.3%和1.4%（n均为6），表明方法重复性良好。

3.8 加样回收率试验

取已知含量的样品（含大黄素0.665 4 mg·g-1、大黄酚1.640 mg·g-1）6份，各约0.5 g，精密称定，分别精密加入对照品溶液（含大黄素 50.00 μg·mL-1、大黄酚125.00 μg·mL-1）各 5 mL，混匀，水浴蒸干，按“3.2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积；另精密吸取混合对照品溶液10 μL，同法测定，外标法计算样品含量，并计算加样回收率，结果见表1。

3.9 样品含量测定

取3批样品适量，分别按“3.2.1”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，记录峰面积；另精密吸取对照品溶液10 μL，同法测定，用外标法计算样品中大黄素和大黄酚的含量，结果见表2。

4 讨论

因大黄的5个蒽醌类成分对当归、桂枝、独活的TLC鉴别有干扰，故先用0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液将其分离出去。曾用石油醚（60～90℃）-醋酸乙酯（4∶1）为展开剂对供试品溶液进行薄层层析，但当归的色谱斑点与桂枝的色谱斑点分离度欠佳，当选用大黄的TLC展开剂系统时，当归、桂枝、独活的色谱成分均能达到有效分离。大黄的蒽醌类成分用0.1 mol·L-1的氢氧化钠溶液分离出来后，用1 mol·L-1盐酸溶液酸化，再用乙醚进行提取，制得的供试品溶液与当归、桂枝、独活的鉴别同板展开。一块板同时鉴别4个药材成分，方便、省时。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery tests（n＝6）

表2 样品含量测定结果Tab2 Results of content determination

本品处方由13味中药组成，其中大黄为主药，大黄素和大黄酚是其主要有效成分，故选其为含量测定指标。参照2010年版《中国药典》（一部）“大黄”项下收载的含量测定方法，采用HPLC法测定两者的总量。结果表明，在选定的色谱条件下，其他成分不干扰大黄素和大黄酚的测定，系统的适用性、方法回收率符合要求，测定结果准确、重复性好。

按2010年版《中国药典》（一部）“大黄”项下的质量要求，结合本制剂大黄的处方量，暂订本品每袋含大黄按大黄素和大黄酚的总量计，不得少于13.0 mg。

[1]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（一部）[S].2010年版.北京：中国医药科技出版社，2010：附录34、22、124、246、259.

[2]郭 澄，王雯佶，江春霞，等.高效液相色谱法测定减肥降脂片中大黄酸、大黄素的含量[J].中国药房，2003，14（4）：241.