粗毛牛膝带腋芽茎段的植株再生研究

刘叶蔓，谢果珍（湖南中医药大学，长沙市 410208）

粗毛牛膝Achyranthes bindentataBL.是苋科多年生草本植物。其根、种子、茎和叶中含有蜕皮甾酮、土牛膝皂苷、生物碱等。药理研究表明，其不同溶剂提取物在强心、抗生育、抗菌和癌细胞凋亡等方面有明显的影响[1]。植物组织和细胞培养技术的发展为药用植物有效成分的工厂化生产提供了一条有效的途径。近年来，关于怀牛膝、川牛膝组织培养方面的研究已有报道[2～4]，但至今仍无粗毛牛膝在组织培养方面的报道。因此，笔者对粗毛牛膝的组织培养进行了初步研究，并获得了再生植株。

1 仪器与材料

1.1 仪器

AF1004型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；DNP-9052型电热恒温培养箱（中新医疗仪器有限公司）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；超净工作台（苏州三兴净化科技有限公司）。

1.2 试药

基本培养基、萘乙酸（NAA）、6-苄基嘌呤（6-BA）均由上海艾研生物科技有限公司提供。

1.3 外植体

以粗毛牛膝带腋芽的嫩茎为外植体。

2 方法

2.1 外植体及处理

外植体经流水冲洗30 min、洗衣粉液浸洗5 min、清水清洗后，在超净工作台用75%的酒精振荡浸润2 min，用无菌水清洗4次，再用0.1%氯化汞消毒15 min，最后用无菌水清洗5次后接种在培养基上。

2.2 培养基及激素配比

选用L9（34）正交设计，根据试验号分别考察基本培养基（A）、NAA浓度（B）和6-BA浓度（C）3个因素对茎段和腋芽生长的影响。每个试验号重复20次，每瓶接种4块，40 d后统计分析结果。计算公式：腋芽生长系数＝腋芽长度（cm）总和/（接种块数－感菌块数）。因素水平见表1。

表1 因素水平Tab1 Factors and levels

2.3 根的诱导

切取生长的腋芽尖端1.5 cm左右接种在1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培养基上。

2.4 培养条件

以上培养温度均为（25±1）℃，1 500 lx光照12 h·d-1，12 h·d-1黑暗。培养基中均含3%蔗糖、0.65%琼脂。pH 5.5～5.8。

3 结果

3.1 基本培养基及激素配比对茎段和腋芽生长的影响

正交试验结果见表2；方差分析结果见表3。

表2、表3结果表明，影响因素顺序是A＞C＞B。A因素（基本培养基）和C因素（6-BA浓度）对腋芽生长各水平之间具有显著意义，B因素（NAA浓度）没有显著性意义。结合实际，最佳培养基组合是A1B1C2，即以MS为基本培养基，添加0.1 mg·L-1NAA和0.5 mg-1L-16-BA，有利于腋芽的萌发和生长。因A1B1C2在正交表找不到，故应作验证试验。

3.2 验证试验

根据A1B1C2配比配制培养基，其他条件同“2.4”项下，接种20瓶，每瓶接种块数4块，40 d统计结果，可得腋芽生长系数达10.210，比表2中最高者（字列号1）还高，表明A1B1C2为最佳培养基组合。

3.3 生根情况

以1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培养基能有效诱导已萌发腋芽的生根，根的数量均在10条以上，生长健壮。

4 讨论

表2 正交试验结果Tab2 Results of orthogonal test

表3 方差分析结果Tab3 Results of variance analysis

笔者考察基本培养基、NAA浓度和6-BA浓度不同配比对粗毛牛膝带腋芽茎段生长的影响。结果表明，基本培养基MS、6-BA浓度对腋芽的生长有显著影响，最佳的培养基组合为MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA，这与文献[5]对川牛膝的研究结果一致。通过验证试验可知，在NAA浓度为0.1 mg·L-1时，适当增加6-BA的浓度，有利于腋芽的生长。在7号试验中，当6-BA达到1.0 mg·L-1时，腋芽生长系数明显降低。说明在一定浓度范围内，较高的6-BA/NAA比值有利于芽的分化和生长，这与文献[6]研究结果一致：在其他因子不变的情况下，细胞分裂素所含浓度越高，丛生芽启动越快，数量也较多，由此看来细胞分裂素对诱导粗毛牛膝外植体脱分化有关键作用。本研究中，不定芽在1/2MS+0.5 mg·L-1NAA培养基上100%生根，且幼根生长健壮，说明粗毛牛膝不定芽诱导生根能力强。本研究结果可为粗毛牛膝的生物技术利用提供理论依据。

[1]蔡光先.湖南药物志[M].长沙：湖南科学技术出版社，2004：79.

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[3]张丽萍，董诚明，金盖宇.怀牛膝组织培养及齐墩果酸定量分析的研究[J].河南中医学院学报，2003，7（4）：32.

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[5]刘 坚，张 挺，陈德茜，等.川牛膝组织培养快繁技术研究[J].中药材，2006，29（5）：425.

[6]蒋泽平，梁珍海，李 劲，等.杂交鹅掌楸的离体培养和植株再生研究[J].江苏林业科技，2004，31（6）：5.