全反式维甲酸对大鼠肾间质纤维化的干扰

王春来 李晶晶

全反式维甲酸［1，2］是维生素A相关药物，在临床上已成功用于治疗白血病，具有抑制细胞增生及诱导分化作用。最近其对肾脏病的治疗尤其是抑制炎细胞浸润及肌成纤维细胞增生方面，开始受到重视。肾小管间质损害程度与肾小球滤过率成负相关，且比肾小球病变更能预测预后［3，4］，肾小管间质纤维化是多种慢性肾脏疾病发展至终末期肾衰的共同途径。本文旨在探讨维甲酸对UUO模型大鼠肾间质纤维化的作用。

1.材料与方法

1.1 动物模型及分组 成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，体重(250～300)g(由辽宁医学院实验动物中心提供)。随机分为3组:正常对照组(假手术组)10只;模型组(UUO组)10只;给药组(all-trans-retinoic acid治疗组)10只。模型组及给药组行左侧输尿管结扎术:3.8%的水合氯醛1mg/kg腹腔麻醉，常规碘酒酒精消毒，腹正中切口进入腹腔，暴露左肾，沿左肾下极寻找到左输尿管并游离，在离左肾下极0.3cm处用丝线上下结扎两处输尿管，然后从中剪断以防逆行性感染，逐层缝合。假手术组只游离但不结扎和剪断输尿管，其他手术过程同另两组;给药组行左侧输尿管结扎术后，每天予维甲酸(10mg/kg)灌胃，前两组每天给予等量生理盐水灌胃。每组大鼠饲养至9天后，处死，取梗阻侧肾，分别固定于福尔马林溶液中。

1.2 实验试剂 维甲酸all-trans-retinoic acid(重庆华邦制药股份有限公司);兔抗人结缔组织生长因子多克隆抗体(武汉博士德有限公司);小鼠抗大鼠α-平滑肌肌动蛋白抗体(美国抗体诊断公司);sp工作液试剂盒(北京中山公司)

1.3 检测指标和方法

1.3.1 组织学检查 肾组织经固定、脱水、石蜡包埋，切片厚2μm，经苏木素-伊红(HE)染色及马松三色染色(Masson)染色，观察肾小管间质病变，由两个观察者对每个样本肾组织的HE染色及Masson染色进行盲法评分，取两观察者评分的平均值。对肾小管间质损害程度采用百分比评分法进行评估，每张标本低倍镜下(100×)依序单盲观察左上、右上、左下、右下、中间5个肾小管间质视野，根据肾小管上皮细胞空泡变性，肾小管扩张，肾小管萎缩，间质水肿、间质纤维化等表现的范围进行评分。无变化为0分，范围＜25%为1分，25% ～50%为2分，范围＞50%为3分。分别计算评分，然后计算平均值，作为该标本的肾小管间质损伤指数。肾间质浸润的炎细胞数，按文献描述的方法［5］，400倍光镜下，每张切片随机选择10个不含肾小球的视野，计算肾间质内炎细胞(单核巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞)结果以(炎细胞/HP×400表示)。

1.3.2 免疫组织化学 4μm的石蜡切片常规脱蜡入水，新鲜配制的3%的过氧化氢10分钟，CTGF微波修复抗原，以蛋白阻断液阻断20分钟，CTGF滴加兔抗人CTGF多克隆抗体(1∶200)，α-SMA滴加小鼠抗大鼠α-SMA抗体，4℃孵育过夜，然后加入生物素化第二抗体，室温20分钟，再加链霉素-生物素-辣根过氧化物酶复合物工作液，室温20分钟，最后用DAB显色，显微镜下控制显色时间，最后以苏木素复染、脱水、透明、封片，实验同时以PBS替代一抗做阴性对照。取各组标本的免疫组化切片，用计算机图象分析软件(CMIAS系列多功能真彩色病理图像分析系统)对所选视野内的免疫组化阳性信号进行计算机读片，以阳性染色区域的积分光密度值做半定量分析测定值。

2.结果

2.1 维甲酸对肾间质病理损害的影响 UUO模型第9天，肾小管扩张、肾小管上皮细胞变性和脱落、肾间质增宽，伴单个核白细胞浸润，甚至出现较严重的肾小管损害和肾间质纤维化，肾小管间质损伤指数评分分值显著高于假手术组(P＜0.01)，维甲酸治疗组肾小管间质损伤指数评分分值显著低于对照组(P＜0.01)，见表1。

表1 各组肾间质损伤指数评分

2.2 维甲酸对肾间质炎细胞浸润的影响 假手术组仅偶见个别炎性细胞。UUO模型组炎细胞(巨噬细胞)浸润逐渐增多，浸润的巨噬细胞主要集中在肾小管间质损害显著处，维甲酸显著抑制肾间质炎细胞浸润，炎细胞数(巨噬细胞)显著低于对照组(P＜0.01)，见表2。

表2 各组肾间质炎细胞数(炎细胞/HP×400表示)

2.3 维甲酸对肾间质α-SMA表达的影响 α-SMA是平滑肌和肌成纤维细胞的标记蛋白。UUO模型组α-SMA阳性染色区域主要集中在肾小管间质病理损害严重处，个别肾小管上皮细胞表达α-SMA，但肾小球未见有α-SMA细胞。维甲酸治疗组间质α-SMA阳性染色区域与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)，肾间质总α-SMA阳性染色区域与肾小管间质损害程度呈显著正相关(r＜0.931)，提示肌成纤维细胞在肾间质纤维化中起重要作用，见表3。

2.4 维甲酸对肾间质CTGF表达的影响 CTGF在假手术组肾间质区无或仅有微量表达，在模型组肾间质可见较多的散在的片状分布，以髓质区最明显，而肾小球未见阳性表达，而治疗组明显减轻(P＜0.01)。免疫组化半定量分析，见表3。

表3 维甲酸治疗对肾间质α－SMA、CTGF的影响

3.讨论

UUO模型是目前广泛用于研究肾间质纤维化比较成熟的动物模型，它所致的肾间质纤维化，与尿路压力升高、缺血、缺氧、炎细胞浸润、氧化应激、细胞因子和生长因子表达增加等因素有关［6］，具有无高血压、无蛋白尿、无血脂异常及无免疫和毒性损害等特点。本研究发现UUO术后9天，小管间质纤维组织增生、炎细胞浸润及细胞增殖明显，部分小管不同程度萎缩、管腔闭塞或扩张、坏死，小管间质区面积扩大，小管细胞基底膜不同程度断裂增厚;与国内外文献报道一致［7］，以上结果表明该动物模型的建立是成功的。

肾间质纤维化是所有慢性肾脏疾病进行性发展的共同最终通路，因此如何防止和控制肾间质纤维化对延缓慢性进行性肾脏疾病的发展至关重要。

维甲酸是维生素A活性代谢产物，它通过与维甲酸受体RAR-α，β，γ和 BXR-α，β，γ结合，调节细胞增生、分化和影响胚胎发育，对多种细胞如平滑肌细胞和肿瘤细胞增生有抑制作用［8，9］，还具有抗炎和调节细胞外基质合成等作用。本研究显示在防治肾间质纤维化方面，全反式维甲酸具有减轻UUO大鼠肾小管间质病理改变的作用，病理结果显示全反式维甲酸组肾小管损伤和间质纤维化程度较UUO组明显减轻，小管间质病理损伤评分P＜0.05。

本研究显示维甲酸可以明显减轻肾间质炎细胞浸润，与对照组相比炎细胞明显减少(P＜0.01)。T淋巴细胞及单核/巨噬细胞［10］为多数情况下肾小管间质病变中的主要浸润细胞，可通过释放淋巴因子、炎症介质、上调趋化因子或黏附分子的表达促进肾脏固有细胞或其自身的活化。外周血中的单核细胞在各种单核细胞趋化因子(MCP-1、RANTES)的趋化作用下可浸润肾间质，活化并增殖为大量的巨噬细胞。最近的动物实验研究中，人们注意到单核巨噬细胞浸润与肾间质纤维化同步。

以往的组织病理技术很难区别浸润的细胞类型，现在的实验技术发展使人们得以进一步认清浸润细胞的种类，除炎症细胞外，还有肌成纤维细胞。α-SMA是平滑肌细胞和肌成纤维的标记蛋白，而肌成纤维细胞在纤维化过程中发挥重要作用。本研究采用免疫组化方法观察肾间质中α-SMA表达以明确肌成纤维细胞的增殖情况。肌成纤维细胞积聚产生过多的ECM，可导致肾小球滤过面积下降，最终导致肾功能衰竭。维甲酸治疗显著抑制肾间质α-SMA，提示维甲酸能减少肾间质成纤维积聚和细胞外基质合成，从而减轻肾间质纤维化。

维甲酸抑制肌成纤维细胞积聚的机制如何?本研究通过免疫组化的方法检测了CTGF。CTGF是TGF-β1的下游因子，而TGF-β1致纤维化已得到证实。CTGF是TGF-β1活性的调节者，CTGF抗体或反义寡核苷酸可减少TGF-β1刺激成纤维细胞和肾小球系膜细胞产生细胞外基质。维甲酸治疗显著抑制肾脏CTGF表达，因此维甲酸可能通过下调肾脏TGF-β1、CTGF表达而抑制肾间质肌成纤维细胞增生。

维甲酸能够减轻UUO模型肾小管间质损伤，减少炎细胞浸润，抑制α-SMA、CTGF表达，减轻肾间质纤维化，可望成为治疗肾间质纤维化的有前途药物。

1 王智，冯金萍，郝淼旺，等.11例急性早幼粒细胞白血病患者并发维甲酸综合征的临床分析［J］.中国实验血液学杂志，2003，11(05):14-18.

2 沈建平，朱宁希，陈均法，等.维甲酸综合征诊断和治疗的探讨［J］.浙江临床医学杂志，2002，4(05):9-14.

3 王海燕.重视和研究小管-间质损害在肾小球疾病发展和预后中的作用［J］.中华肾脏病杂志，2000，16(01):5-6.

4 Yang N，Wu LL，Nikolic-Paterson DJ，et al.Local macrophage and myofibroblast proliferation in progressive renal injury in the rat remnant kidney［J］.Nephrol Dial Transplant，1998，13(8):1967-1974.

5 田少江，贾汝汉，丁国华，等.阿托伐他汀对肾间质纤维化大鼠间质巨噬细胞增殖的影响［J］.中国医师杂志，2003，(04):65-67.

6 Kawada N，Moriyama T，Ando A，et al.Increased oxidative stress in mouse kidneys with unilateral ureteral obstruction［J］.Kidney Int，1999，56(3):1004-1013.

7 Fan JM，Ng YY，Hill PA，et al.Transforming growth factor-beta regulates tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation in vitro［J］.Kidney Int，1999，56(4):1455-1467.

8 De Luca LM.Retinoids and their receptors in differentiation，embryogenesis，and neoplasia［J］.FASEB J，1991，5(14):2924-2933.

9 Chen S，Gardner DG.Retinoic acid uses divergent mechanisms to activate or suppress mitogenesis in rat aortic smooth muscle cells［J］.J Clin Invest，1998，102(4):653-662.

10 赵雅妮，李惊子，王海燕.巨噬细胞在肾脏损伤中的作用［J］.中国病理生理杂志，2004，20(11):2147-2150.