消瘀散及水提物与醇提物体外透皮特性的比较研究

肖立新 ，彭力平 *，陈光宇 ，何 群 ，王 适

（1.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2.深圳市中医院，广东 深圳 518033）

消瘀散由大黄、牡丹皮、白芷、姜黄、蒲黄、薄荷、栀子等10味中药组成，其功能主治为活血化瘀，消肿止痛，系我院用于治疗急性软组织损伤（血瘀证）的外用中药协定处方，临床应用已取得了满意的疗效[1]。但散剂剂型较陈旧而且调制麻烦，临床使用中起效慢、容易脱落、易过敏、易污染衣物、药物浪费大等诸多缺点日益突出，因此我们急需对其进行剂型改革。因剂型不同，对药材前处理的要求不同，总体分水提与醇提两类，本试验在提取工艺初筛的基础上，以药粉（散剂）作对照，以大黄素[2]为检测指标，对水提物与醇提物用改良的Franz扩散池及离体兔皮进行体外透皮实验，比较透皮速度、透皮百分率与皮肤储量的差别，以探索两种提取工艺经皮渗透性能的差别，为剂型选择的可行性、合理性提供依据，为进一步的药效、毒理及临床研究奠定基础。

1 实验材料

Agilent-1200LC高效液相色谱系统 (美国安捷伦公司，包括G1311A四元梯度泵,G1313A标准型自动进样器，G1316A柱温箱，G1314A紫外检测器，Agilent Chemstation色谱工作站)；岛津UV 2450型紫外可见分光光度计；KUDOS SK3300H型浴式超声仪 （上海科导超声仪器有限公司）；MA110型电子分析天平 （上海第二天平仪器厂）；Franz扩散池（S=3.036 cm2V=23.5 mL）；ZTY 智能透皮实验仪PP2A（巩义市英峪予华仪器有限公司）；岛津电子分析天平（日本）AUY-120。大黄素（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号110756-200110）；消瘀散 （湖南中医药大学附属第一医院制剂中心提供）；消瘀散水提物与醇提物（自制）；甲醇为色谱醇；其它试剂均为分析醇；双蒸水（自制）。动物：新西兰大白兔由湖南中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(湘)2009-0012。

2 方法与结果

2.1 消瘀散、水提物、醇提物供试品的制备方法

2.1.1 消瘀散 处方中药材粉碎，过120目筛，混匀，备用。

2.1.2 消瘀散水提物 处方中药材适当碎断，姜黄、薄荷等含挥发油的药材提取挥发油，用研磨法制成β-环糊精包合物；残渣与剩余药材水煎煮2次，合并煎液，减压浓缩成稠浸膏，真空干燥得干浸膏，按等量递增法加入挥发油包合物，混匀，备用。

2.1.3 消瘀散醇提物 处方中药材粉碎，过10目筛，加乙醇回流2次，滤过，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩至无醇味，再于水浴上浓缩成稠浸膏，真空干燥得干浸膏，备用。

2.2 大黄素的HPLC定量方法

2.2.1 色谱条件 Phenomenex C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脱：0～25 min（75∶25）；25～35 min(75∶25→85∶15)；35～40 min(85∶15→75∶25)；40～50 min(75∶25)；流速1.0 mL/min；检测波长 254 nm；进样量 10 μL；柱温为30℃。

2.2.2 对照品溶液的制备 取大黄素对照品16.5 mg，精密称定，加甲醇溶解并定容至10 mL，取1.0 mL用甲醇定容至10 mL，再取1.0 mL用甲醇定容至10 mL作为对照品溶液，大黄素质量浓度为16.50 μg/mL。

2.2.3 供试品溶液的制备 分别取消瘀散及水提物与醇提物 (3种供试品生药浓度一致)约3.0、2.3、1.6 g左右，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇25.0 mL，超声30 min，放冷，再精密称定质量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过。精密量取续滤液5.0 mL，挥去溶剂，残渣加8%盐酸溶液10 mL，超声处理2 min，再加三氯甲烷10 mL，超声30 min，放冷，置分液漏斗中，用少量三氯甲烷(约5 mL)洗涤容器，并入分液漏斗中，振摇萃取，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 阴性对照液的制备 取不含大黄的其余9味药材按相应的提取方法制备成散剂，再按“2.2.3”法将提取物样品处理成分析用样品 （即阴性供试品溶液）。

2.2.5 分离条件的考察 按“2.2.1”色谱条件，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照液各10μL，注入高效液相色谱仪内，调整出峰时间及峰形，使达到符合要求的分离效果，同条件下阴性无干扰。见图 1～5。

2.2.6 样品中大黄素含量测定 分别精密吸取对照品与3种供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定峰面积，用外标一点法计算大黄素含量。

图1 大黄素对照品HPLC图

图2 消瘀散水提物样品HPLC图

图3 消瘀散醇提物样品HPLC图

图4 消瘀散散剂样品HPLC图

图5 大黄阴性样品HPLC图

2.2 离体兔皮的制备和处理

取体质健康的新西兰大白兔1只，耳缘静脉注射空气后致死，剥离兔皮，小心除去皮下脂肪和组织，用新鲜配置的生理盐水反复冲洗，用剪刀除去腹部的兔毛（切勿损伤皮肤），以8%的硫化钠溶液涂布在离体皮肤上，5 min后用棉签去除褪下的兔毛，然后用生理盐水冲洗干净，最后浸泡于生理盐水中，-26℃超低温冰箱中保存备用，1周内用完。每次实验前1 h取出，同时检查兔皮的完整性，不能有任何破损。

2.3 实验装置及步骤

采用改良的单室Franz扩散池，将生理盐水加入到接收池中，真皮层一侧面向Franz扩散池的接收池，螺丝加固，确保无气泡产生，使其与离体兔皮紧密接触，紧贴于离体兔皮上，并观察接收池中接触兔皮面有无气泡，若有气泡，从取样口排除气泡，并补充生理盐水至刻度。将固定好装置的Franz扩散池放入ZTY智能透皮实验仪PP2A中，水浴温度37℃，电磁恒速搅拌（60 r/min），分别取各实验样品2 g，精密称定，装入供给池中，使之紧贴表皮层无气泡，计时，分别在透皮时间为 4、6、8、10、12、24、30、36、48、60、72 h 时，从接收池中取出 12 mL 接收液，同时补充等量的生理盐水，同样保持接收液面与皮肤之间无气泡产生。

2.4 透皮样品的处理

精密吸取每个时间点取出的透皮接收液，分别置于100 mL的锥形瓶中，蒸干，加8%盐酸溶液5 mL，超声处理2 min，微孔滤膜滤过，取续滤液，高效液相进样10μL测定。分别计算消瘀散及水提物与醇提物中大黄素的累计透过百分率。

2.5 皮肤储量的测定

将最后一次取样后的皮肤取下，用剪刀剪去扩散池口上对应的皮肤以外的皮肤部分，将扩散池口大小的皮肤用眼科小剪刀尽快剪碎成皮肤碎块，用移液管先取总量2/3的生理盐水于烧杯内，将盛有皮肤碎块的小烧杯放入冰水中，将剪碎的皮肤倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的1/3冷的生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎皮肤块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数10次（6～8 min），充分研碎，使皮肤碎块匀浆化。然后加8%盐酸溶液10 mL， 超声处理10 min， 离心 （4 000 r/min，15 min）取上层清液，微孔滤膜滤过，取续滤液10μL，进高效液相色谱仪测定大黄素含量。

2.6 消瘀散及水提物与醇提物累计透皮百分率的测定结果见表1、图6。

表1 消瘀散及水提物与醇提物的累积透皮百分率 （%）

图6 消瘀散及水提物与醇提物体外经皮渗透动力学曲线图

2.7 散剂及水提物与醇提物中大黄素透皮动力学数学模型的拟合

对表1中消瘀散及水提物与醇提物的体外透皮试验结果采用几种接近的数学模型进行拟合，建立透皮动力学方程（数学模型），见表2。

由数学模型拟合结果可知，消瘀散及水提物与醇提物中大黄素累积透皮百分率与时间t的函数关系，散剂最接近JohnsonSchumacher模型，水提物最接近一元线性回归模型，醇提物最接近逻缉斯蒂模型，将找出的最优数学模型（数学方程）列于表3。

表2 消瘀散及水提物与醇提物中大黄素透皮动力学数学模型的拟合

表3 消瘀散及水提物与醇提物中对应的大黄素透皮动力学最优数学方程

2.8 消瘀散及水提物与醇提物中大黄素体外透皮动力学参数的提取及比较

由表4中的计算结果可知，透皮速度快的T8%值小，透皮总量多者Q72h大，消瘀散及水提物与醇提物的透皮速度参数T8%值、透皮总量参数Q72h值可信区间未重叠，差别有统计学意义，故透皮速度由快至慢依次为：醇提物＞水提物＞散剂；透皮总量由多至少依次为：醇提物＞水提物＞散剂；水提物的体外透皮速率是散剂的2.529倍，水提物透皮总量是散剂的2.806倍；醇提物的体外透皮速率是水提物的2.178倍，是散剂的5.509倍，醇提物的体外透皮总量是水提物的1.932倍,是散剂的5.421倍。

表4 各组中大黄素透皮动力学参数的提取及比较（可信区间重叠法）[4]

2.9 消瘀散及水提物与醇提物中大黄素皮肤储存量的测定结果

由表5可知，各组大黄素皮肤储量测定结果95%可信区间皆未重叠，差别有统计意义，故皮肤储量由高到低依次为：醇提物＞水提物＞消瘀散，醇提物是水提物的4.21倍，是散剂的16.63倍，水提物是散剂的3.95倍。

表5 消瘀散及水提物与醇提物中大黄素皮肤储存量的测定结果 （n=3）

3 讨论

本实验原设计拟采用3个评价指标综合评分，但因本方系10味中药的大复方，有效成分含量低、干扰大，最终仅大黄素通过梯度洗脱成功分离，可定量检测。

药物透皮属被动扩散机制，与药物的脂溶性成正比，醇提物脂溶性成分提取量多，故透皮速度比水提物快、透皮总量多；散剂中药物必须先从细胞内向细胞外扩散到皮肤表面，然后才能透过皮肤，故透皮速度慢，透皮总量少，药物大部分未进入皮内发挥作用；水提物因无药渣，故透皮速度、透皮总量介于两者之间。

由实验结果可知，12 h之前，各组透皮速度相差不大，12 h之后，差别显著，变化最大的是12～48 h这段时间，48 h透皮量趋于饱和，故透皮速度参数定为消瘀散透皮最大量对应的时间即T8%，透皮总量参数定为72 h对应的累积透皮百分率。

外用制剂经皮渗透特性主要参数有透皮速度及某时间的透皮量，这两个参数不能直接测出，通过实验测得的不同时间透皮百分率数据，建立两者的函数关系（数学方程），函数关系（数学方程）有多种（γ＞γ临），通过比较 R2（包括抽样误差）、F、P 值，找出最优数学模型（数学方程），R2、F愈大，P值愈小，说明该函数关系（数学方程或数学模型）愈准确，误差愈小，进而求出的透皮速度及某时间的透皮量愈正确，误差范围愈小。

[1]林松青，彭力平.消瘀散治疗急性软组织损伤的临床疗效研究[J].中医正骨，2009，4（21）：10-11.

[2]陈德昌,景炳文,杨兴易.大黄对烫伤大鼠肝脏内细胞因子基因表达的影响[J].中国危重病急救医学，1999，10（11）：587-590.

[3]沈阳药学院.高等数学（下册）[M].上海：上海科学技术出版社，1979：389.

[4]何 群，邓桂明，杨广民，等.咳喘穴位贴片与贴散体外透皮特性比较研究[J].中国中药杂志，2007，32（18）：1 877-1 880.