密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼症泪腺组织中白细胞介素-1β表达的影响

陈佳文，彭清华*，姚小磊*，王 方，李怀风，吴权龙

（湖南中医药大学第一附属医院眼科学重点学科，湖南 长沙 410007）

干眼症是由于泪液的量或质的异常，泪膜不稳定和眼表损害而导致的一组眼不适症状，又称角结膜干燥症。其多发生于大于60岁的女性，是常见的眼表疾病[1]。目前干眼症的病因尚未明确，炎症可能是各种类型干眼症发病的共同机制，而雄激素水平的异常可能是此炎症反应发生的重要原因[2]。前期研究[3]表明密蒙花提取物治疗可显著抑制雄激素水平降低后兔干眼症的发生，其作用机制可能与黄酮类物质发挥拟雄激素效应,从而调节泪腺局部炎症反应有关。为揭示密蒙花总黄酮治疗雄激素水平降低所致干眼症的治疗机制，为临床推广应用进一步提供科学依据，本实验观察了其对去势导致干眼症雄鼠泪腺组织中白细胞介素-1β表达的影响。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康、无眼部疾患、1个月龄Wistar雄性大鼠150只，由中南大学湘雅医学院实验动物中心提供，SPF级，远交系，体质量100 g左右。动物合格证号：SCXK（湘）2009-0004。

1.1.2 药物 密蒙花（产于湖南邵阳）：密蒙花干药材由湖南九汇现代中药有限公司提供，其总黄酮制备由课题组在湖南省植物提取工程提取中心完成（密蒙花药材中蒙花苷含量为0.85%，提取成品中蒙花苷含量约17%，蒙花苷中总黄酮含量＞80%）；丙酸睾酮注射液 （25 g/L，天津金耀氨基酸有限公司生产，国药准字H12020531）。

1.1.3 试剂 鼠抗人IL-1β单克隆抗体：重庆生物技术有限公司生产；SABC试剂盒：重庆生物技术有限公司生产；DAB显色剂：重庆生物技术有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 实验动物随机分为正常组、假手术对照组、模型组、丙酸睾酮组、密蒙花总黄酮组，每组30只；每组造模后1，3，5月各10只。动物模型制作[4]，将实验鼠切除双侧睾丸及附睾；假手术组只切开阴囊而不切除睾丸，正常组不做任何处理。造模后1周，待伤口基本愈合开始用药。正常组、假手术对照组、模型组以生理盐水灌胃，1次/d；丙酸睾酮组用丙酸睾酮注射液1 mg/kg大腿肌内注射，1次/3 d；密蒙花总黄酮组以密蒙花总黄酮20 mg/kg与生理盐水混悬液灌胃，1次/d。造模后1，3，5个月后各组10只大鼠，20%乌拉坦腹腔注射全身麻醉下断头法处死动物，即刻摘除双眼眶外泪腺，低温保存，用4%多聚甲醛固定，供免疫组织化学方法检测使用。

1.2.2 免疫组织化学法检测IL-1β的表达 标本常规脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡，采用免疫组织化学SABC法，按试剂盒说明书进行操作。各组标本切片后均按试剂盒说明书进行染色，阳性对照采用乳腺癌石蜡切片，阴性对照采用PBS液代替一抗。结果判定：阴性对照染色结果未见IL-1β特异性免疫反应产物。阳性结果为组织细胞质内出现明确棕黄或棕褐色颗粒。Image-proplus4.5图像分析系统测定每张切片阳性表达的累计光密度值。在40×10的高倍视野下，每张切片选择具有代表性的5个阳性视野，选取空白区定标，测定每个视野的光密度，求其平均值。平均光密度值越小，表示阳性反应产物表达越强烈。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠泪腺IL-1β表达的病理形态学改变

正常泪腺上皮细胞为高柱状，核居基底部，泪腺上皮细胞近腔间有大量分泌泡状黏液细胞。腺体中泪滴多而细胞浆内无明显棕黄色颗粒沉着，即无IL-1β阳性表达。本研究中病理形态学改变以去势造模后5个月才明显。去势造模后5个月正常组和假手术对照组泪腺组织中可见少许棕黄色颗粒沉着，即IL-1β几乎无阳性表达；模型组组织切片中有大量棕黄色颗粒沉着，即IL-1β大量阳性表达；丙酸睾酮组和密蒙花总黄酮组组织切片中可见IL-1β有表达，即有较多棕黄色颗粒沉着（见图1）。

图1 密蒙花总黄酮对去势雄鼠干眼症泪腺组织IL-1β病理形态学影响光镜图（免疫组化染色×200）

2.2 各组大鼠泪腺组织中IL-1β表达比较

泪腺组织中IL-1β的表达比较：造模后1，3，5月，正常组、假手术组IL-1β平均光密度值低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；密蒙花总黄酮组和丙酸睾酮组平均光密度值低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）；正常组、假手术对照组的IL-1β表达显著低于丙酸睾酮组、密蒙花总黄酮组（P＜0.05）；密蒙花总黄酮组平均光密度值高于丙酸睾酮组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠泪腺IL-1β阳性反应细胞的平均光密度值 s，n=10）

表1 各组大鼠泪腺IL-1β阳性反应细胞的平均光密度值 s，n=10）

注：与模型组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与丙酸睾酮组、密蒙花总黄酮组比较*P＜0.05。

时间1月3月5

3 讨论

近年来研究表明基于免疫的炎症反应是各种类型干眼症发病的共同机制,干眼症患者泪液和结膜上皮中的多种细胞因子包括 IL-1α、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β的水平较正常人有显著改变，且与干眼症的严重程度相关[5]，而性激素水平的异常可能是导致此炎症反应发生的重要因素[2]。刘超等[6]通过去势雄兔实验研究进一步认识到雄激素水平降低可能通过细胞信号转导途径，对靶基因转录的调控发生改变，导致一系列细胞因子表达的改变，主要通过加重眼表组织炎症反应及细胞凋亡途径，损伤泪腺结构、降低泪腺分泌功能；并且通过加重角膜炎症反应及细胞凋亡，加重症状，导致干眼症。而目前对干眼症炎症反应研究较多的是IL-1和TGF，因为IL-1是最重要的促炎因子[7]。Solomon[8]认为IL-1在角结膜干燥症（KCS）发病中起关键作用，因为干眼症常常伴随着IL-1浓度增加。IL-1β可以刺激单核细胞和巨噬细胞产生IL-6和TNF；通过单核细胞和巨噬细胞产生IL-8介导对中性粒细胞的趋化作用；刺激中性粒细胞释放炎症介质；促进肝细胞合成急性时相蛋白；诱导内皮细胞活化，促进血管内皮细胞表达，黏附分子增加，白细胞与VEC的粘附，诱导内皮细胞分泌IL-2、IL-6和PG等，引起炎症[4]。通过本实验研究中模型组IL-1β随时间延长而增加，且5个月后模型组与正常组比较差异仍有显著性，也证实了去势后大鼠缺乏雄激素将导致IL-1β的增加。

密蒙花属清热泻火药，为马钱科落叶灌木密蒙花树的花蕾，性甘，微寒，归肝经；有清热（泻火）养肝，明目退翳之功效；主治目赤翳障，目昏干涩等症。密蒙花在中医眼科古籍中作为君药早有治疗干眼症的论述，如密蒙花散。现代对密蒙花的研究发现：密蒙花含有刺槐素、密蒙花苷、密蒙花萜苷、木犀草素等。其中小鼠口服刺槐素能减轻甲醛性炎症，还能降低皮肤、小肠血管的通透性及脆性[9]。其抗炎成分为总黄酮和苯乙醇苷[10]。用放射性示踪标记方法研究还表明密蒙花提取物中含有大量黄酮类物质，黄酮类物质是细胞膜雄激素受体的刺激物，可以与细胞膜雄激素受体结合发挥生物学效应[11]。密蒙花中的黄酮类化合物可与泪腺、角膜等眼表组织中的雄激素受体结合[12]。近期研究表明：密蒙花黄酮类提取物对实验性雄激素水平下降所致干眼症有良好的治疗效果，其机制主要与密蒙花黄酮能够有效调节泪腺局部炎症反应和细胞凋亡，上调TGF-β1mRNA的表达以增加TGF-β1的合成等有关，能改善泪腺组织结构，从而维持泪液基础分泌量[13-19]。

本实验研究发现，模型组泪腺组织中IL-1β的表达显著升高，同时，透射电镜下可见泪腺组织中出现大量炎性细胞[20]。由此说明，去势导致的雄激素水平下降而使IL-1β的生成明显增加，致使泪腺局部产生细胞炎症反应，最终导致干眼症。而丙酸睾酮组肌注丙酸睾酮较模型组明显要低，说明雄激素治疗干眼症主要是通过免疫抑制作用而起到治疗作用。本研究表明，密蒙花总黄酮可通过抑制IL-1β的合成而延缓3个月及5个月后雄激素水平下降所致干眼症的进展，密蒙花总黄酮抑制IL-1β水平可能是干眼症中其抑制泪腺组织细胞炎症反应的重要机制之一。

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