桑生除痹合剂对兔膝骨性关节炎组织形态学和血液流变学的影响

王 平，卢启贵，徐 展，孙克民，黄东红，裴代平

（深圳平乐骨伤科医院关节病科，广东 深圳 518010）

骨性关节炎（Osteoarthritis，OA）是中老年人常见、多发和比较难治的一种慢性进行性骨关节病。随着年龄的增长和社会人口老龄化进程加剧，OA的发病率明显增高，严重危害着中老年人的健康。桑生除痹合剂是国家级名老中医郭春园教授的经验方，经深圳平乐骨伤科医院制剂车间按现代工艺生产用于治疗骨性关节炎，经多年临床应用收到较好的效果。本实验旨在通过组织病理切片技术、血液流变学分析，观察桑生除痹合剂对家兔膝关节炎的软骨、滑膜组织的病理改变和血液流变学的影响，研究桑生除痹合剂防治0A的作用机制。现将实验方法及结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 健康6月龄新西兰大白兔36只，体质量（2 000±100）g，雌雄各半，由上海医用动物实验中心提供，合格证书：SCXK(沪)2002-0011。采用一兔一笼喂养方式，室温20～25℃，相对湿度45%～60%，每日正常光照，空气流通，自由摄食、饮水。

1.1.2 药物 桑生除痹合剂由深圳平乐骨伤科医院制剂室提供，制剂批准文号：粤药制字04000136。药物：桑寄生、续断、山药、枸杞子、五加皮、骨碎补、防风、羌活、防己、秦艽、威灵仙、白术、茯苓、泽泻、当归、川芎、白芍、生地黄、川牛膝、牡丹皮、地龙、木瓜、甘草。壮骨关节丸主要由狗脊、骨碎补、淫羊藿、独活、木香、鸡血藤、川断、熟地黄等药物组成（南方制药厂生产，批号：N20050815）。

1.1.3 试剂 苏木素染色液；伊红染色液；丽春红酸性品红液；苯胺蓝液；Weigert氏铁苏木精；MAIXINBIO RapId CalImmunoTM快速脱钙液（福州迈新生物技术开发有限公司提供）。

1.1.4 仪器 北京世帝R80-A全血黏度仪；德国MicroTec CUT 4060切片机；显微镜日产Olympus vanox型。

1.2 方法

1.2.1 动物分组方法 随机分为6组，正常组：正常喂养；模型组：造模后不用药；余下4组，壮骨关节丸组：造模后灌服壮骨关节丸；桑生除痹合剂低、中、高剂量组（以下简称低、中、高剂量组）：造模后灌服低、中、高剂量桑生除痹合剂。

1.2.2 模型制作 同等条件下适应性喂养1周后，取模型组、壮骨关节丸组、桑生除痹合剂低、中、高组，均按照Hulth法行改良手术造模[1]，各组动物于手术前禁食水10 h，以兔左膝为手术对象，无菌条件下实行手术。术前用3%戊巴比妥钠按30 mg/kg的剂量行耳缘静脉麻醉，并配合盐酸利多卡因注射液局部肌注麻醉以松弛肌肉。麻醉后，将兔仰卧捆绑于兔解剖台上，左膝关节局部脱毛、备皮、消毒、铺巾，取髌内侧纵切口，长约2 cm，依次切开皮肤，浅、深筋膜，在直视下分离、切断内侧副韧带，打开膝关节腔，完整摘除内侧半月板并切断前交叉韧带，术中尽量避免损伤关节软骨面，抽屉试验、内侧应力实验证实各韧带完全切断后，冲洗，彻底止血，逐层缝合，无菌敷料包扎，不固定伤肢。

1.2.3 给药方法 术后连续3 d青霉素肌注20万单位，每日2次，以预防感染。手术1周后，每天强迫动物活动30 min，分2次驱赶。给药剂量均按50 kg成年人体表面积换算，每天灌胃量为10 mL。高剂量组含生药量为5.06 g/mL；中剂量组含生药量为2.53 g/mL；低剂量组含生药量为1.27 g/mL。壮骨关节丸组每天灌胃量为10 mL，含生药量为0.12 g/mL。将药物碾磨，用生理盐水配制成浓度为0.12 g/mL混悬溶液。药物置4℃冰箱中保存备用。

1.2.4 标本采集 用静脉空气栓塞法处死实验动物，立即打开兔患膝关节腔，用手术解剖刀紧贴关节囊内壁，小心剥取膝关节前正中的部分关节滑膜，置入EP管内，10%福尔马林固定。用骨剪取股骨内侧髁关节负重区软骨，修成5 mm×5 mm×3 mm的全软骨层标本，10%福尔马林固定，MAIXIN-BIO Rapid Cal Immuno TM快速脱钙液脱钙，梯度乙醇常规脱水，二甲苯透明后浸蜡包埋。连续4μm厚切片，铺片，烘干，滑膜标本作HE染色，软骨标本1份作HE染色，1份作Masson三色染色。各组动物于取材前禁食10 h，将兔仰卧位固定于兔台上，备皮，用注射器滴入少许2%肝素生理盐水，使之充满骨穿针腔。用一次性注射器自耳中动脉抽取4 mL血，注入抗凝试管，摇匀，室温下保存，3 h内送检。

1.2.5 观察指标 （1）关节滑膜及软骨病理组织学观察：光镜下观察关节滑膜及软骨组织形态学改变。（2）血液流变学测定：全自动血液流变仪检测血流变学指标。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 桑生除痹合剂对兔膝关节软骨、滑膜的组织形态学的影响

图1（1-3）（1）均为正常组关节软骨面表面平滑，无钙化，表层细胞小而扁平，少见细胞分裂，4层结构清晰可辨，软骨细胞排列成柱状，未见软骨细胞簇，潮线完整；（2）Masson染色软骨胶原蓝绿色，钙化软骨及骨的胶原呈红色；（3）滑膜细胞呈单层排列，间质无水肿，无炎性细胞浸润聚积，有的可见少量毛细血管增生；图1（4-6）（4）均为模型组关节软骨表层菲薄，粗糙，部分因受蚀损，表面剥脱、纤维化，形成缺损区，可见多个空隙窝，部分区域成绒毛状，表层裂隙多且深，向下能深达辐射层，裂隙中可见稀疏结缔组织及松散的网状连接，裂隙周围可见脱水固缩坏死的软骨细胞，软骨细胞排列不规则，各层结构不易分辨，潮线多不完整或完全消失，软骨细胞增生显著，大部分是散在增生和巢状增生，部分软骨细胞核固缩坏死，偏于一侧，钙化层可出现软骨细胞簇积现象；（5）Masson染色见软骨蓝绿色染色丢失严重，潮线上普遍有向上的火焰状突起的红染物，几乎达到软骨表层；（6）滑膜明显增厚，纤维组织大量增生，滑膜可见大量炎性细胞浸润、聚积，滑膜下毛细血管增生，间质水肿；图 1（7-9）（7）均为壮骨关节丸组软骨面粗糙，表面有少许表浅裂隙，但裂隙表浅，软骨细胞排列较整齐，呈柱状，表浅层软骨细胞大量消失，放射层软骨细胞萎缩，钙化层软骨细胞轻度成簇，但细胞增生明显少于模型组，潮线较整齐，部分软骨剥脱，出现少许空隙窝；（8）Masson染色见全层未钙化软骨蓝绿染色达2/3以上，红色火焰状升起相对低而少；（9）滑膜细胞、纤维组织轻度增生，毛细血管增生，间质有水肿，伴有少量淋巴细胞浸润；图 1（10-12）（10）均为中剂量组软骨表面尚光滑，软骨细胞排列整齐，呈柱状，未见明显软骨剥脱，无明显空隙窝，细胞减少现象不明显，软骨细胞核萎缩，细胞增生散在，簇状增生少见，潮线完整，未见有软骨蚀损；（11）Masson染色全层没钙化软骨蓝绿染色保存较完整；（12）滑膜未见明显炎性细胞浸润，滑膜上皮无增生及间质水肿；图1（13-15）均为低剂量组关节软骨变化基本同模型组；图1（16-18）均为高剂量组介于模型组、壮骨关节丸组之间，较壮骨关节丸组退变重。结果见图1。

图1 桑生除痹合剂对兔膝关节软骨、滑膜的组织形态学影响光镜图（×200）

2.2 桑生除痹合剂对兔血液流变学的影响

全血黏度低切变模型组和正常组、壮骨关节丸组、中剂量组、高剂量组间差异有统计学意义 (P＜0.01)，与低剂量组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，正常组、壮骨关节丸组和各治疗组间差异无统计学意义(P＞0.05)；中切变模型组和正常组、中剂量、高剂量组间差异有统计学意义(P＜0.01)；模型组和壮骨关节丸组间差异有统计学意义(P＜0.05)，正常组、壮骨关节丸组和各治疗组间差异无统计学意义(P＞0.05)；高切变模型组和正常组、中剂量组、高剂量组间差异有统计学意义(P＜0.01)，和壮骨关节丸组、低剂量组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，低剂量组和中剂量组间差异有统计学意义(P＜0.05)。全血还原黏度低切变模型组和壮骨关节丸组、中剂量组、高剂量组间差异有统计学意义(P＜0.05)；中切变模型组和正常组间差异有统计学意义(P＜0.05)，模型组和壮骨关节丸组及各治疗组间差异有统计学意义(P＜0.01)，正常组、壮骨关节丸组和各治疗组间差异无统计学意义(P＞0.05)；高切变模型组和壮骨关节丸组、低剂量组、中剂量组间差异有统计学意义(P＜0.05)。血浆黏度壮骨关节丸组和低剂量组间差异有统计学意义(P＜0.05)，低剂量组和中、高剂量组间差异有统计学意义(P＜0.05)。红细胞聚集指数模型组和正常组、壮骨关节丸组、高剂量组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 桑生除痹合剂对兔膝OA模型血液流变学的影响 s，n=6）

表1 桑生除痹合剂对兔膝OA模型血液流变学的影响 s，n=6）

注：与模型组比较▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与中剂量组比较 &P＜0.05；与高剂量组比较 #P＜0.05；与低剂量组比较$P＜0.05。

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3 讨论

骨性关节炎 (OA)实验动物模型的建立是研究OA病理机制及防治的必要手段，经大量的实验研究证实，诱发模型中，Hulth造模方法成功率较高，造模手术后5 d即有软骨退变出现，术后6周即可获稳定OA。本实验采用改良Hulth造模方法，唯一区别于Hulth的方面，只是切断前交叉韧带，而不是将前后交叉韧带都切断。这样做使实验动物膝关节尚存一定的稳定性，不致于加重对膝关节的破坏。本实验造模方法较Hulth造模法操作简单、创伤小，通过手术造成的膝关节长期慢性应力失常，最终发展为膝0A。此模型导致软骨退变基本符合临床上的发生机理。同时为了缩短动物模型制作期，根据临床上超疲劳活动容易提前出现OA的发病特点，对模兔采用单笼喂养，使之有一定活动范围，并每日驱赶动物以增加术侧膝关节的磨损及负重机会。通过观察实验兔的一般情况，发现模型组家兔均有不同程度的左膝关节跋行、关节活动范围受限及关节畸形等表现，与OA病人的临床症状与体征相似；同时本实验模型组组织形态学及检测指标来看，也证实术后其软骨退变己非常明显，与临床骨关节炎的病理改变相似，从而证实了改良Nulth造模在本次实验应用的可靠性及可行性。

OA在中国传统医学中归属痹病之骨痹范畴。近年来，中药在防治OA的实验研究方面取得了很大进展，叶俊星等[2]用骨痛胶囊治疗兔OA,证明骨痛胶囊内服能有效的降低兔膝关节骨内高压，明显改善骨髓内血液流变学状态。童敏等[3]运用骨康合剂对兔膝OA治疗，结果显示骨康合剂能通过改善骨关节炎血流动力学和血液流变学状态，防止退行性改变。陈飞雁等[4]在观察威灵仙注射液对骨关节炎模型动物关节软骨胶原表型的作用中发现，威灵仙组能够延缓异常胶原表达的出现，有效缓解基质胶原降解破坏的程度。胡敏等[5]研究益气通络方对兔软骨细胞活性及代谢反应的调节规律，发现益气通络方通过阻断分解代谢细胞因子,防止胶原纤维转型而促进细胞增殖。师彬等[6]证实活骨丸能够改善股骨头血液流变学特性，改善微循环，扭转股骨头缺血状态，促进骨髓修复再生，抑制股骨头坏死的发生与发展。桑生除痹合剂采用深圳市平乐骨伤科医院国家级名老中医郭春园教授的经验方，经本院制剂车间按现代工艺生产，用于治疗骨性关节炎方，经多年使用收到较好的效果。功能补肾健骨、化痹止痛，主要用于治疗骨性关节炎的筋骨痿软、肿胀疼痛等症。从关节软骨的退变来看，模型组关节软骨破坏严重，壮骨关节丸组和治疗组均显示存在软骨增生、龟裂、局部缺损，但经药物治疗，壮骨关节丸组、实验Ⅱ组、实验III组退变程度明显小于模型组，表明桑生除痹合剂可以减少或阻断软骨的丢失，修复损害的软骨。现代研究认为滑膜炎症在OA的发病中起着重要的作用，吴红娟等[7,8]的实验提示，药物对OA的疗效与其能降低关节滑液NO水平有关。实验中组织学观察见模型组滑膜充血水肿甚至增生。关节囊肥厚、增生、粘连，滑膜炎性表现严重。而治疗组的炎性细胞浸润明显低于模型组，证实桑生除痹合剂可以作用于软骨及滑膜细胞，抑制炎性介质的释放，减轻滑膜炎症，增加软骨细胞的代偿能力，达到防治OA的效果。近年来，许多学者证实，中药可促进软骨细胞增殖和抑制软骨细胞凋亡[9-11]。在实验中观察到中剂量组、高剂量组的家兔关节软骨面虽也有粗糙，但裂隙表浅，细胞增生散在，簇状增生少见，且未见软骨蚀损，明显优于模型组。我们认为桑生除痹合剂可以增加软骨细胞的代偿能力，调整软骨细胞的代谢向正常轨道转换，进而促进软骨机制中的代谢成分向正常方向改变，并且还可提高细胞的耐受力，对软骨的降解起一定的缓解作用，具有良好延缓软骨退变的作用。从基质着色改变方面观察：模型组动物开始即有基质着色的浅弱和不均，表现更为严重，有些部位则全部丢失，壮骨关节丸组、中剂量组、高剂量组也有着色的减少，但减少程度轻，中剂量组趋于正常。实验组在丢失严重的部位见到软骨细胞周围的浓染，说明软骨细胞仍在旺盛地合成基质，揭示用药组的软骨细胞受到药物影响，具有更强、更持久的合成基质的能力。本实验表明桑生除痹合剂可以减少或阻断软骨片的丢失和刺激滑液分泌的途径，修复损害的软骨，延缓软骨退变，对膝OA滑膜增生和炎细胞浸润有抑制作用，对OA病变发展有抑制作用，其中中剂量组疗效更佳。

研究表明静脉瘀滞、骨内高压可能是骨性关节炎发病的原发因素，骨内微循环障碍是其关键环节。骨内静脉瘀滞首先是微循环瘀滞，从而引起骨内高压的主要因素已获普遍认可。在形成骨内高压这一过程中，血液流变学异常表现为：血细胞压积增加，全血和血浆比粘度增加，血浆纤维蛋白原增加，凝血速度加快，红细胞和血小板在血浆中电泳缓慢，红细胞沉降率加快。由于这些变化，使血液运行不畅，易致血栓形成、血管栓塞，静脉回流受阻。静脉瘀滞引起骨内压力升高，进而导致骨内血液灌注量减少，使骨内呈贫血状态，造成骨髓组织缺血、缺氧，酸性代谢产物聚积，滑膜也因关节内高压而使血流量减少，静脉郁积导致滑膜分泌酸性滑液，微循环系统的局部反馈机制失调，毛细血管周围肥大细胞释放组织胺，血浆外渗，引起组织水肿及微循环血液的浓缩，血栓形成，从而导致血液灌注量进一步减小，骨内压和关节内压进一步升高，如此形成恶性循环[2]，不可避免的破坏局部组织的正常理化环境，从而导致关节软骨的退行性改变。从实验结果看，全血黏度、全血还原粘度模型组和壮骨关节丸组、中剂量组、高剂量组间差异有统计学意义，红细胞聚集指数模型组和壮骨关节丸组、高剂量组间比较差异有统计学意义，说明造模3月后血液粘滞性增加，经药物干预后可明显改善血液粘滞性，其中以高剂量组最佳，疗效与剂量呈相关性。本实验结果证实了桑生除痹合剂能显著改善血液流变学状态，从而达到保护关节软骨、治疗骨性关节炎的目的。

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