土鳖虫超微粉体中尿嘧啶、次黄嘌呤的含量测定

万 丹，蔡 萍，张水寒*

（湖南省中医药研究院，湖南省中药粉体与创新药物省部共建重点实验室，湖南省教育厅中药粉体技术创新团队，湖南 长沙 410013）

土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌体干燥体，在我国具有悠久的药用历史。具有散血瘀、消坚结、解凝活血、接骨续筋、消肿止痛、下乳通经等功效。土鳖虫水提液可以降低高脂血症大鼠血清TC、TG、LDL-C并升高HDL-C和SOD水平，减少循环内皮细胞(CEC)，维持NO和内皮素(ET)平衡,对血管内皮细胞起到了保护作用[1]。目前2010年版药典还未收录土鳖虫含量测定方法。景晶[2]等建立的HPLC分析时间较长，刘丽芳[3]等用HPLC只测定出尿嘧啶的含量，未检测出次黄嘌呤。本文建立了HPLC同时测定尿嘧啶、次黄嘌呤的含量，为评价土鳖虫超微粉体内在质量提供一定的参考依据。

1 实验材料

1.1 仪器

岛津LC-10ATVP高效液相色谱仪，配置SPDM10AVP型二极管阵列检测器、CTO-10ASVP柱温箱，CLASS-VP岛津工作站；KQ3200型超声波清洗器（220V，40KHz）； BFM-T6BI“贝利”微粉机（济南贝利粉碎技术工程有限公司）；旋涡混合器（金坛市大地自动化仪器厂）；T-214型电子分析天平 （北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试剂

试剂均为分析纯；对照品：尿嘧啶（中国药品生物制品检定所，供含量测定用批号：100469-200401）；次黄嘌呤（中国药品生物制品检定所，供含量测定用，批号：140661-200903）；水为重蒸馏水。

1.3 药材

10批土鳖虫药材分别购自四川、广西、湖南、陕西、江西、安徽等地，经湖南中医药研究院生药鉴定室温俊达副研究员鉴定为地鳖、冀地鳖及金边土鳖虫雌体。土鳖虫经贝利粉碎机粉碎后，加工成超微粉体。粒径检测采用Winner3001干粉激光粒度仪，结果D50均小于13μm，＜75μm的颗粒累积在95%以上。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为依利特Hypersil C18BDS柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为0.05 mol/L磷酸氢二铵水溶液，检测波长为254 nm，流速为0.4 mL/min，柱温为25℃。

2.2 供试品溶液的制备

取样品约1 g，精密称定,置具塞锥形瓶中，加入 25 mL水，称质量，超声提取30 min，放至室温，再称质量，补足减失的质量，滤过，离心，吸取滤液过0.45μm微孔滤膜，备用。

2.3 对照品溶液的制备

分别称取尿嘧啶、次黄嘌呤对照品5.5 mg、5.2 mg，分别加水制得浓度为22μg/mL尿嘧啶溶液及21μg/mL次黄嘌呤溶液。色谱图见图1。

图1 土鳖虫超微粉体HPLC图谱

2.4 标准曲线的制备及线性关系考察

精密吸取尿嘧啶（22μg/mL）、次黄嘌呤对照品溶液（21 μg/mL）2、4、6、8、10 μL，注入高效液相色谱仪，测定，以峰面积为纵坐标，进样量（μL）为横坐标，绘制标准曲线。

y=184 723x-16 842，r=0.999 5，线性范围 0.044～0.220 μg；

y=196 570x-19 578，r=0.999 5,线性范围 0.042～0.210μg

2.5 精密度试验

精密吸取“2.3”项下的尿嘧啶对照品溶液，连续重复进样5次，计算各对照品色谱峰面积相对标准偏差，RSD为2.1%。

2.6 重复性试验

取同一份样品（湖南产，批号：20100803）6份按“2.2”项下方法制备，进样测定，计算尿嘧啶、次黄嘌呤含量，RSD分别为2.2%、2.0%。

2.7 稳定性试验

取“2.2”项下的同一份供试品溶液（湖南产，批号：20100803）， 分别在制备后 0、2、4、6、8、12、24 h进样10μL，计算尿嘧啶、次黄嘌呤含量，RSD分别为2.5%、2.2%。

2.8 回收率试验

取已知含量的（湖南产，批号：20100803）超微粉6份精密称定，分别加入一定量的对照品，按“2.2”项下方法制备，进样测定，计算回收率。结果表明，本方法加样回收率较好。结果见表1。

2.9 样品含量测定

取不同产地土鳖虫样品，按“2.2”项下方法制备，平行操作，分别吸取对照品和供试品溶液各10μL，进样分析，计算含量，见表2。

表1 加样回收率测定结果（n=6）

表2 不同批次土鳖虫超微粉体中尿嘧啶、次黄嘌呤的含量 （mg/g）

3 讨论

色谱条件的选择：比较了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.05 mol/L磷酸氢二铵水溶液及0.05 mol/L磷酸氢二铵水溶液，因为土鳖虫中尿嘧啶、次黄嘌呤为核苷类物质，极性较大，在0.05 mol/L磷酸氢二铵水溶液，流速为0.4 mL/min，柱温为25℃的条件下分离度最好。

从表2中结果可知，尿嘧啶、次黄嘌呤在冀地鳖、地鳖中含量高低不一，种内差异达到3倍以上，本次实验以河北产冀地鳖含量最高。金边土鳖虫并没有收录入2010年版药典，但在我国福建、广西、广东等地多有养殖，且价格比地鳖、冀地鳖贵。本实验收集了1批金边土鳖虫药材，从实验结果看，金边土鳖虫中尿嘧啶、次黄嘌呤的含量均不高。三种土鳖虫中尿嘧啶、次黄嘌呤的含量是否有差别还有待进一步研究。

[1]于 燕，刘继兰，王菊英，等.土鳖虫水提物对实验性高脂血症大鼠血管内皮和内皮素的影响[J].中国生化药物杂志，2003，24(1)：15-17.

[2]景 晶,曹 红.HPLC法测定土鳖虫中尿嘧啶和尿囊素的含量[J].药学实践杂志，2010,28(2)：134-136.

[3]刘丽芳,金蓉鸾,徐国钧.HPLC法测定十种动物药中尿嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、脲苷的含量[J].中国中药杂志，1999,24(2)：73-76.