螺内酯对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞增殖及 TGF-β1、FN 分泌的影响

郭晓理，朱隽雅，施 辉*，王德琴，徐美玉

(1南通大学附属医院，江苏 南通 226001;2海安县人民医院)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病(DM)常见并发症，其主要的病理改变是肾小球系膜细胞(GMCs)增殖及异常增多，细胞外基质(ECM)过度沉积。转化生长因子β1(TGF-β1)是其病理改变的主要介导物，不仅可上调ECM蛋白表达，还可降低ECM蛋白降解酶的活性。ECM的主要成分是FN，FN增多是ECM过度沉积的标志。2009年9月～2010年3月，本研究观察了高糖刺激对大鼠GMCs增殖的影响，并进一步观察了螺内酯干预后对大鼠GMCs增殖及TGF-β1、FN分泌的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 大鼠GMCs购自上海长征医院肾内科。低糖、高糖DMEM培养液，青—链霉素组合双抗为Gibco公司产品。胎牛血清为杭州四季青公司产品。0.25%胰蛋白酶，24孔、96孔培养板为碧云天公司产品。螺内酯、二甲基亚砜(DMSO)为Sigma公司产品。噻唑蓝(MTT)为Amresco产品，ELISA试剂盒由博士德提供。Thermo MK3酶标仪为美国赛默飞世尔科技公司生产。

1.2 方法

1.2.1 大鼠GMCs培养 大鼠 GMCs常规培养在含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液中，置37℃5%CO2孵箱中培养。2～3 d传代1次。取对数生长期GMCs用于实验。分组:①低糖(5.5 mmol/L)对照组(LG组);②高糖(25 mmol/L)对照组(HG组);③SPI1 组(HG+0.25 μmol/L 螺内酯);④SPI2组(HG+2.5 μmol/L 螺内酯);⑤SPI3 组(HG+25 μmol/L螺内酯);⑥SPI4 组(HG+50 μmol/L 螺内酯)。每组设6个复孔。

1.2.2 螺内酯对大鼠 GMCs增殖的影响 采用MTT法。调整细胞密度至1×105个/ml，将GMCs接种于96 孔板，每孔 200 μl。分别培养 12、24、48 h，于培养结束前4 h加入20 μl的MTT溶液，37℃继续孵育4 h弃上清，加入150 μl的DMSO振荡。用酶标仪(波长490 nm)测定OD值。

1.2.3 TGF-β1、FN 的检测 采用 ELISA 法。调整细胞密度至2×105个/ml，将 GMCs接种于24孔板，每孔1000 μl。培养24 h后，检测不同浓度螺内酯作用后 TGF-β1、FN 的含量。并检测 25 μmol/L螺内酯作用12、24、48 h 时 TGF-β1、FN 的含量。操作过程严格按ELISA试剂盒操作说明进行。

1.3 统计学方法 采用Stata7.0统计软件，数据以表示，组间比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 螺内酯对各组大鼠GMCs增殖的影响 见表1。

表1 各组大鼠GMCs增殖比较(n=6，)

表1 各组大鼠GMCs增殖比较(n=6，)

注:与 NG 组比较，*P ＜0.05;与 HG 组比较，△P ＜0.05，△△P＜0.01;与同组12 h比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;与同组24 h比较，●P ＜0.05，●●P ＜0.01;同一时间各组间比较，#P ＜0.05

组别GMCs增殖OD值12 h 24 h 48 h NG组0.521 ±0.0554 0.523 ±0.0687 0.560 ±0.0262 HG 组 0.592 ±0.0591 0.601 ±0.0455*# 0.614 ±0.0362*#SPI1 组 0.592 ±0.0142 0.510 ±0.0880△# 0.423 ±0.0159△△▲▲●#SPI2 组 0.521 ±0.0142# 0.417 ±0.0251△# 0.364 ±0.0453△△▲▲●#SPI3 组 0.436 ±0.0533△△# 0.363 ±0.0506△△# 0.291 ±0.0380△△▲▲●#SPI4 组 0.354 ±0.0330△△# 0.287 ±0.0499△△# 0.209 ±0.0320△△▲●●#

2.2 螺内酯对TGF-β1、FN分泌的影响 见表2、3。

表2 各组培养24 h TGF-β1、FN含量比较(n=6，ng/ml，)

表2 各组培养24 h TGF-β1、FN含量比较(n=6，ng/ml，)

注:与 NG 组比较，*P ＜0.01;与 HG 组比较，△P ＜0.01;各浓度组后一浓度与前一浓度比较，#P ＜0.01，##P ＜0.05

组别 TGF-β1FN NG组0.55 ±0.04 74.5 ±8.9 HG 组 1.03 ±0.03* 118.8 ±6.1*SPI1 组 0.98 ±0.07 103.4 ±7.3△#SPI2 组 0.62 ±0.05△# 81.6 ±6.5△#SPI3 组 0.44 ±0.08△# 68.9 ±5.4△#SPI4 组 0.35 ±0.03△## 51.1 ±6.2△#

表 3 25 μmol/L 螺内酯作用 12、24、48 h TGF-β1、FN含量比较(ng/ml，)

表 3 25 μmol/L 螺内酯作用 12、24、48 h TGF-β1、FN含量比较(ng/ml，)

注:各时间组后一时间组与前一时间组比较，*P＜0.01，＊＊P＜0.05

检测项目 25 μmol/L螺内酯作用12 h 24 h 48 h TGF-β1 0.69 ±0.06 0.44 ±0.08* 0.34 ±0.05＊＊FN 80.70 ±9.20 68.90 ±5.40＊＊ 60.10 ±7.80＊＊

3 讨论

GMCs增殖是DN突出的病理学特征，是引起肾小球ECM增多，并进一步导致肾小球硬化的重要原因。肾素—血管紧张素—醛固酮系统在肾脏纤维化中起着重要作用，但醛固酮的作用一直被忽视。有研究显示，醛固酮可不依赖于肾素—血管紧张素的效应引起靶器官和血管损伤、纤维化。醛固酮可通过 TGF-β1、钠氢交换子 1 等诱导 ECM 增生［1，2］。螺内酯是醛固酮受体拮抗剂，其化学结构与醛固酮类似，是醛固酮的竞争性抑制剂，有弱效利尿作用。近年研究证明，醛固酮也是肾纤维化过程中一个重要因素。因而，螺内酯具有预防和减轻肾脏纤维化的作用［3，4］，能下调 TGF-β1，减少Ⅰ型胶原的沉积和FN的分泌，减轻了小管间质纤维化［5］。

正常生理情况下，ECM处于不断产生和降解的动态平衡中。GMCs增殖后，可导致 ECM大量分泌，而ECM对GMCs有正反馈作用，以致这类物质在基质中聚集增多［6］。当各种损伤因子和有害成分如高糖、细胞因子等出现或发生改变时，以上的平衡被打乱，GMCs的形态和功能发生改变，细胞因子和ECM分泌增多［7］。本研究结果表明，高糖环境下GMCs增殖明显，ECM分泌增多。使用螺内酯干预后增殖受到抑制，基质分泌减少，且呈剂量依赖性。其原因可能与螺内酯能下调TGF-β1等细胞因子水平有关。以往研究发现，体外高糖环境对GMCs的生长具有双重作用，早期可以刺激细胞增殖，48 h后则抑制细胞增殖［8］。本研究将25 mmol/L葡萄糖作用于GMCs发现，48 h内可促进GMCs的增殖，未出现对细胞的抑制作用，与报道相符，并随作用时间的延长，细胞增殖越明显，具有时间依赖性。

综上所述，螺内酯可以抑制高糖诱导的GMCs增殖及ECM的分泌，为螺内酯防治DN提供了一定的实验依据。但螺内酯长期使用会引起水、电解质平衡紊乱，虽然本实验无明显的细胞损伤，若长期使用，有待进一步研究。

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［7］房辉，徐刚，于德民，等.TGF-β1和ECM与糖尿病肾病关系的实验研究［J］.中国糖尿病杂志，2000，8(4):227-230.

［8］Wolf G，Sharma K，Chen Y，et al.High glucose induced proliferation in mesangial cells is reversed by autocrine TGF-beta［J］.Kindney Int，1992，42(3):647-656.