原代自体表皮细胞悬液移植对烧伤大鼠的治疗作用

王晓晔，左海亮，崔华雷

(天津市儿童医院，天津 300074)

表皮细胞的损伤是皮肤损伤的起始和病理生理基础。关于表皮细胞移植治疗深度烧伤，文献报道各有不同，对表皮细胞的移植密度尚无明确定论。2009年1～7月，我们进行了不同密度原代自体表皮细胞的移植，观察治疗烧伤的效果，探讨最佳的表皮细胞移植密度。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 选取健康Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量(130±10)g。随机分为A组(移植密度6.0×104/cm2)、B组(移植密度 1.2×105/cm2)、C组(移植密度2.4×105/cm2)和 D 组(对照组)，每组15只。

1.2 烧伤模型的制作 大鼠术前禁食6 h，腹部皮肤消毒后，予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉。麻醉满意后，剔除背部鼠毛，形成约2 cm×2 cm无毛区，用胶带粘贴四周。将大鼠侧放悬空，无毛区暴露充分。用95℃热水，直接倾倒于无毛区，时间约40 s，造成Ⅲ度烧伤模型(病理检查确定烧伤程度)。伤后10 min，生理盐水10 ml腹腔注射。单笼饲养，每日予氨苄青霉素4万U肌注。每日伤口清洁消毒。

1.3 自体表皮细胞制备 烧伤模型制作后第3天，在同一只大鼠腹部皮肤消毒后，予10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉。麻醉满意后，于其大鼠背部(与烧伤区域不同)消毒剃毛后分别选择0.8 cm ×0.5 cm 小块面积取皮，共约 2 cm2，皮肤缺损部位用缝皮针线缝合。获取的皮肤在0.25%胰蛋白酶和0.04%EDTA中消化16 h下消化，消化方法为冷消化法和真皮刮除法，0.4%台盼蓝染色活细胞计数。制备成密度为1×106个/ml表皮细胞悬液备用。

1.4 移植密度和方法 于烧伤后第4天切痂，用移液器调整好所需要的剂量分别移植，液量不足240 μl的用培养液补足。

1.5 指标观察 移植后的创面是否发生感染，发生感染的例数，各组创面情况、愈合情况、创面伤口的收缩比例等。创面收缩比例计算参照纸片模板法，并根据实际情况作相应调整。收缩比例=(1－愈合后面积/原始创面面积)×100%。

1.6 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件，瘢痕愈合数据比较采用χ2检验，收缩比例数据比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

移植的30只大鼠中，A组成活14只，死亡1只;B组成活14只，感染导致移植失败1只;C组成活14只，感染导致移植失败1只;D组(对照组)均成活。

移植后第3天开始出现针尖样皮岛，散在分布。C组最多，B组次之，A组最少，D组未见皮岛。各创面均有渗出，有软结痂形成的趋势。皮岛在随后的几天中逐渐扩大，类似集落样向四周扩展，至相互接触。创面逐渐由不平整向光滑发展，A组明显较B组和C组慢，B组和C组未见明显差异。第7～11天B组和C组创面表面光滑、平整，红润有光泽;A组创面表面不平整，红润有光泽;D组创面瘢痕，凹凸不平。第12～17天B组和C组创面颜色逐渐由红润变得与周围肤色相近;A组创面也渐变平整，颜色逐渐由红润变得与周围肤色相近;D组创面收缩严重;第18～21天各组创面基本无变化，治疗组创面平整形成生理性愈合，对照组创面不平整，瘢痕愈合。各组瘢痕愈合例数及创面收缩比例见表1。

表1 不同移植密度愈合情况

3 讨论

目前细胞移植封闭治疗烧伤创面的方法和类型有多种:自体表皮细胞移植、异体表皮细胞移植、自—异体表皮细胞移植［1］、自体间充质细胞移植［2，3］。异体和自—异体表皮细胞移植采用异体细胞，由于免疫排斥反应的存在，只能暂时封闭创面，异体细胞最终脱落，创面再次暴露［4］，并且增加感染和瘢痕愈合的风险，不是细胞移植的首选方法。自体表皮细胞移植是治疗深度烧伤和皮肤缺损类疾病的根本途径，既维持了表皮封闭创面的保护组织、机械屏障的功能，又无瘢痕形成，创口收缩不明显，这样就可保持正常的皮肤形态和功能。

自体细胞移植可分为原代自体细胞移植和传代自体细胞移植。近几年来实验研究发现，原代自体表皮细胞移植有良好的治疗效果［5，6］:①可以尽早应用于临床，封闭切痂后的创面。②缩短烧伤创面愈合时间。通过种植细胞的直接成活和再生，可以快速促进烧伤创面的愈合，进而减少各种并发症的发生。③扩增倍数大。④与基底面结合牢固［7］。⑤创面愈合好，瘢痕形成少，甚至无瘢痕形成。

对移植密度的测算，我们设计了6.0×104/cm2、1.2 ×105/cm2、2.4 ×105/cm2三个梯度移植密度。结果表明，在表皮细胞移植后第3天创面可见散在针尖样白点——皮岛，随着时间增长，皮岛的面积在不断扩大。此时基底部渗出物形成一层半透明的膜状物，并可于其下发现淡红色线条，考虑为微毛细血管的增生，组织切片HE染色证实。半透明状物逐渐变为不透明，考虑一方面是表皮细胞增殖分化形成复层结构;另一方面是肉芽组织增生，纤维组织日益增多。但是毕竟表皮层尚不完全，此时的膜逐渐变为淡红色，仍考虑为基底部毛细血管长入。随着时间变化，创面的颜色又逐渐变为白色。因此，移植密度1.2×105/cm2和2.4×105/cm2在瘢痕愈合的数量上是无统计学意义的，移植密度在1.2×105/cm2即可达到要求。

另外，创面收缩是愈合过程中正常和必须的过程［8］，其中伤口收缩是加速伤口愈合的重要环节，但是过度地收缩则会导致挛缩的发生，引起严重的外形与功能障碍。本研究结果表明，无论治疗组还是对照组均存在一定程度的创口收缩，通过测量愈合后的面积发现，治疗组均存在创口收缩的问题，但是收缩的程度不同。其中，移植密度为1.2×105/cm2和2.4×105/cm2在伤口收缩面积上是无统计学意义的。因此，移植密度1.2×105/cm2是比较适宜的移植密度。

综上所述，原代自体表皮细胞移植具有快速、简便、可操作性强、经济等优点，是一种治疗深度烧伤和皮肤缺损类疾病的良好手段。

［1］Xiao S，Zhu S，Li H，et al.Feasibility study of composite skin reconstructed by mixing keratinocytes and acellular dermal matrix for wound repair［J］.Swiss Med Wkly，2009，139(1-2):16-21.

［2］Kim SS，Song CK，Shon SK，et al.Effects of human amniotic membrane grafts combined with marrow mesenchymal stem cells on healing of full-thickness skin defects in rabbits［J］.Cell Tissue Res，2009，336(1):59-66.

［3］Riekstina U，Muceniece R，Cakstina I，et al.Characterization of human skin-derived mesenchymal stem cell proliferation rate in different growth conditions［J］.Cytotechnology，2008，58(3):153-162.

［4］Drewa T，Nadolski B，Czaplewski A，et al.Application of autologous and allogenic keratynocyte cultures in burn management［J］.Przegl Lek，2005，62(9):934-937.

［5］Wood FM，Stoner ML，Fowler BV，et al.The use of a non-cultured autologous cell suspension and integra dermal regeneration template to repair full-thickness skin wounds in porcine model:a one-step process［J］.Burns，2007，33(6):693-700.

［6］吕国忠，朱宇刚，周红梅，等.大鼠自体异体表皮细胞悬液混合移植到实验研究［J］.中华烧伤杂志，2003，19(1):29-31.

［7］王珍祥，吴军，李世荣.放射治疗瘢痕挛缩的生物学机制［J］.现代康复，2001，5(12):35-36.

［8］Gravante G，Di Fede MC，Araco A，et al.A randomized trial comparing ReCell system of epidermal cells delivery versus classic skin grafts for the treatment of deep partial thickness burns［J］.Burns，2007，33(8):996-972.