尼可地尔超极化停搏对小香猪心肌的保护作用及其对c-Fos蛋白表达的影响

阎兴治 ，常忠路，向道康，张文斌，张大国，舒义竹，刘秀伦

(1贵州省人民医院，贵阳 550002;2山东中医药大学第二附属医院)

心肌缺血—再灌注损伤是体外循环(CPB)后心肌功能损害形成心脏与其他脏器功能不全或衰竭的主要原因，因此心肌保护仍是一个重要研究课题。尼可地尔是一种硝酸盐化合物，在体内可激活ATP敏感性钾(KATP)通道，增加细胞内cGMP生成，提高心肌抗缺氧能力。研究显示，尼可地尔对离体及体内缺血—再灌注损伤的心肌有明显的保护作用［1，2］。2009年6～7月，我们观察了冷血停跳液中加入尼可地尔作为超极化停搏因子对c-Fos蛋白表达的影响，并探讨尼可地尔对心肌的保护作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 幼年小香猪12只，雌雄不限，体质量(20.0±5.5)kg(贵阳中医学院实验动物中心提供)。德国StocketⅡ型体外循环机，西京-87型鼓泡式氧合器，Adinstruments多导生理记录仪，Swan-Ganz漂浮导管，尼可地尔(重庆新原兴药业公司，批号:070201)，心肌肌钙蛋白I(cTnI)试剂盒(大连泛邦生物公司)，c-Fos蛋白试剂盒(北京中杉金桥生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 随机将小香猪分为对照组、实验组各6只。对照组:高钾去极化含血停搏液［由 St Thomas液(NaCl 110.0 mmol/L，CaCl21.6 mmol/L，MgCl216.0 mmol/L，KCl 16 mmol/L)与血液按1∶2混合］;实验组:尼可地尔超极化含血停搏液［由尼可地尔 0.2 mmol/L［3］加入 Krebs-Henseleit液中 (NaCl 118.0 mmol/L，KCl 4.74 mmol/L，KH2PO40.93 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，CaCl21.5 mmol/L，Glucose 1.0 mmol/L)与血液按1∶2混合］，两种停跳液 pH、PaO2、PaCO2相似。两组均以首次剂量15 ml/kg灌注，每隔30 min按8 ml/kg追加灌注一次维持心脏停搏状态。

1.2.2 检测指标 ①腹腔注射氯胺酮20～30 mg/kg，待意识消失，给予芬太尼 5 μg/kg、哌库溴铵 4 mg后经口插入气管导管，接呼吸机行机械通气，插入肛表监测肛温，解剖股静脉置入补液管，生理仪连接四肢监测心脏电—机械活动。胸部正中切口常规建立CPB，慢慢降温至30℃时阻断升主动脉，经主动脉根部灌注心脏停搏液，记录心脏停跳所需时间;每隔30 min重复灌注一次维持心脏停跳状态，阻断90 min后开放升主动脉。②实验中分别于CPB开始后即刻(T1)，阻断升主动脉后 45、90 min(T2、T3)，开放升主动脉后 45 min、90 min、6 h(T4、T5、T6)抽取静脉血3 ml，置于干燥试管中，8℃静置20 min后，3000 r/min离心10 min，留血清置于 －70℃保存。采用ELISA法检测血清cTnI水平。③开放升主动脉后90 min时取左室心尖部心肌标本0.3 cm ×0.4 cm ×0.3 cm，立即放入 bouin氏液中低温浸泡、固定24 h后，取出放入75%乙醇溶液浸泡低温保存。心肌标本经过洗涤、脱水、透明浸蜡包埋后制成石蜡切片，PowervisionTM二步法免疫组化染色测定c-Fos蛋白，以抗体染色后c-Fos蛋白表达的细胞核呈黄褐色为阳性，每张切片随机选取5个高倍(×200)视野，半定量测定、计算心肌c-Fos蛋白阳性表达率。④每组随机取3例左室心尖部心肌组织，采用H600型透射电镜观察超微结构变化并照片。

1.3 统计学方法 采用SPSS11.0统计软件，数据以表示，计量资料比较采用t检验，计数资料比较用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组心肌电—机械活动情况 实验组致猪心脏停跳所需时间为(57.7 ±7.3)s，对照组为(49.0±6.3)s，两组比较差异无统计学意义。升主动脉开放心脏复跳后，实验组有4例出现一过性室颤，对照组仅有1例，两组一过性室颤发生率比较P＜0.05。其中，实验组2例自动恢复、2例用电能5 J除颤2次恢复窦性心律，对照组1例自动恢复窦性心律。

2.2 两组血清cTnI水平比较 见表1。

表1 两组动物不同时间血清cTnI水平比较 (ng/ml，)

表1 两组动物不同时间血清cTnI水平比较 (ng/ml，)

注:与对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组别 n T1 T2 T3 T4 T5 T6实验组 6 0.063 ±0.008 0.842 ±0.131 1.783 ±0.248＊＊ 2.950 ±0.501＊＊ 2.231 ±0.414*2.093 ±0.254对照组 6 0.064 ±0.011 0.853 ±0.149 2.250 ±0.327 3.433±0.294 2.617 ±0.343 2.280 ±0.318

2.3 两组c-Fos蛋白阳性表达率比较 两组缺血—再灌注心肌组织中均有c-Fos蛋白表达，实验组与c-Fos蛋白阳性表达率为(0.18±0.09)%，对照组为(0.29±0.12)。两组c-Fos蛋白阳性表达率比较 P ＜0.05。

2.4 两组电镜下超微结构比较 实验组小香猪心肌纤维排列整齐、无断裂，线粒体基本无肿胀，线粒体嵴相对清晰，无断裂，糖原颗粒较多;对照组心肌纤维疏松，排列紊乱，部分断裂、溶解，线粒体肿胀，部分线粒体空泡样变，线粒体嵴紊乱、模糊不清并有断裂，糖原含量少。

3 讨论

通过升高心肌细胞外K+浓度诱导心脏去极化停搏是一种应用广泛的心脏停搏技术，但是去极化停搏后伴随Na+、Ca2+超载引起的离子平衡紊乱，将不可避免地导致心肌损伤。因此，有学者提出了维持心肌细胞膜电位(Em)在超极化状态，即低于静息Em的心脏超极化停搏［4］。KATP通道开放剂的心脏停搏机制通常认为是由于细胞膜对K+相对电导远远强于对Na+相对电导，因此心肌细胞静息Em(－80 mV)接近于K+平衡电位(－94 mV)。KATP通道开放剂诱导KATP通道激活，将增加细胞膜对离子的电导差异，导致Em向K+平衡电位移动(较先前的Em超极化)。如果Em保持低于－65 mV的状态，那么触发动作电位的电压依赖性快Na+通道将不能被激活，心脏即停搏于舒张期［5］。其理论上的优点为:①在超极化停搏状态下，心肌细胞质膜中的离子通道或泵极少被激活，可减少心肌高能磷酸盐的消耗;②心肌细胞静息 Em处于超极化状态，Na+、Ca2+通道关闭，减少缺血心肌细胞Na+、Ca2+超载，进而减轻心肌缺血—再灌注损伤。

尼可地尔可通过激活KATP通道并使之开放诱导心脏超极化停搏，主要是通过加快动作电位第3期K+外流而缩短单相动作电位时间，造成Na+、Ca2+内流减少，从而减少Ca2+释放和心肌的收缩活动，降低ATP的消耗，从而减轻细胞的缺血性坏死［6］。本实验结果显示，尼可地尔有良好的心肌保护作用，但其致心律失常作用明显。这可能与尼可地尔引起的心肌细胞KATP通道的普遍开放，使膜电位下降有关，其一方面抑制了钙超载和基质肿胀，减轻了心肌损害;而另一方面则缩短了动作电位时程和有效不应期，使折返易于诱发和维持，加重了心律失常的发生危险。因此，我们认为KATP通道开放剂的价值评估还需进一步全面、系统的研究。

cTnI是一种心肌收缩调节蛋白，心肌细胞受损时开始释放入血，是心肌损伤的特异性指标。本实验结果显示，实验组血清cTnI释放量明显低于对照组，说明KATP通道开放剂尼可地尔超极化停搏可以更好地维持心肌细胞正常结构，减轻心肌细胞缺血—再灌注损伤。从形态学上观察，其超微结构损伤较对照组明显减轻。

c-Fos蛋白是一种可以诱导细胞凋亡的即刻早期基因c-Fos的蛋白产物，是心血管系统应激反应基因和蛋白，细胞内钙超载和氧化应激可以引起c-Fos过度表达［7］。Nelson 等［8］在对心肌缺血—再灌注损伤的研究中发现，即刻早期基因c-Fos和c-Jun、TIS7/PC4均表达增高，这些基因的表达既参与CPB介导炎症反应相关基因的激活，又参与损伤后的心肌和血管重构。本实验结果显示，c-Fos蛋白表达实验组明显低于对照组，表明超极化停搏有良好的心肌保护作用，其机制可能为尼可地尔超极化停搏抑制细胞内钙超载、减轻线粒体基质肿胀进而抑制c-Fos蛋白表达有关。

［1］鹿欣，刘立群，陈维宁，等.尼可地尔后处理联合预处理对离体心肌缺血/再灌注的作用研究［J］.中华临床医师杂志，2007，1(6):28-33.

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［3］Steensrud T，Muller S，Endresen PC，et al.Clinical testing of nicorandil supplemented normokalemic cardioplegic solution［J］.Interact Cardiovasc Thorac Surg，2006，5(5):521-525.

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［5］Hoenicke EM，Sun X，Strange RG Jr，et al.Donor heart preservation with a novel hyperpolarizing solution:superior protection compared with University of Wisconsin solution［J］.J Thorac Cardiovasc Surg，2000，120(4):746-754.

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［7］Maulik N，Sasaki H，Addya S，et al.Regulation of cardiomyocyte apoptosis by redox-sensitive transcription factors［J］.FEBS Lett，2000，485(1):7-12.

［8］Nelson DP，Wechsler SB，Miura T，et al.Myocardial immediate early gene activation after cardiopulmonary bypass with cardiac ischemia-reperfusion［J］.Ann Thorac Surg，2002，73(1):156-162.