Survivin在肾盂移行细胞癌和输尿管移行细胞癌中的表达

罗小瑾 ，尉立京，邹国平，胡 群

（1.宜春市人民医院泌尿外科，江西 宜春 336000；2.山东大学山东省立医院泌尿外科，济南 250021）

肾盂和输尿管移行细胞癌是泌尿系统中常见的恶性肿瘤，早期诊断、及时治疗是改善预后的关键。目前，肾盂和输尿管移行细胞癌的术前诊断主要依靠影像学检查和尿细胞学检查［1］。建立快速、特异、非侵入性的检测方法将有利于肾盂和输尿管移行细胞癌的早期诊断，特别对治疗后监测复发有着重要的意义。为此本研究对肾盂和输尿管移行细胞癌患者的手术摘除标本与尿脱落细胞中存活素（Survivin）［2］的表达进行了分析研究，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集1995年4月至2010年4月在山东省立医院泌尿外科和宜春市人民医院泌尿外科住院治疗的肾盂和输尿管移行细胞癌患者158例。1）根据WHO行病理分级:肾盂移行细胞癌113例（肾盂癌组），男 71 例，女 42 例，年龄 35～80 岁，平均 57.8岁。其中Ⅰ级28例、Ⅱ级61例、Ⅲ级24例。输尿管移行细胞癌45例（输尿管癌组），男30例，女15例，年龄40～76岁，平均56.7岁。其中Ⅰ级 11例、Ⅱ级27例、Ⅲ级7例。另选择肾积水、重复肾等非肿瘤患者的肾盂标本10例作为阴性对照（对照组）。2）选取肾盂移行细胞癌患者尿脱落细胞标本25例，男16例，女9例，年龄41～66岁，平均54.3岁。 其中Ⅰ级7例、Ⅱ级12例、Ⅲ级6例。输尿管移行细胞癌患者尿脱落细胞标本10例，男6例，女4例，年龄40～76岁，平均 56.3岁。其中Ⅰ级3例、Ⅱ级 5例、Ⅲ级2例。另选择肾积水、重复肾等非肿瘤患者10例为对照组。所有肾盂和输尿管移行细胞癌的诊断均经术后病理证实。

1.2 主要试剂

Survivin单克隆抗体、链酶亲和素－生物素－过氧化物酶免疫组化染色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 检测方法

1）手术标本按病理科常规处理。免疫组化染色采用链霉菌抗生物素蛋白——过氧化物酶连接法（SP法）。常规石蜡切片、脱蜡、水化、微波抗原修复（10 mmol·L－1柠檬酸缓冲液，pH6.0），过氧化氢（H2O2）作用5 min后加Survivin抗体，SP法严格按试剂说明书标准步骤进行，DAB显色，苏木精复染。用免疫组化图像分析系统分析阳性率，测定阳性细胞吸光值。2）取200 mL新鲜尿液离心弃上清，对沉渣中红细胞先用红细胞溶解液［氯化铵（NH4CL）155 mmol·L－1、碳酸钾（K2CO3）10 mmol·L－1、乙二胺四乙酸（EDTA）1 mmol·L－1］作用 5 min 加以破坏，离心，弃上清液，取细胞沉渣涂片。涂片干燥后用4%多聚甲醛固定5 min，微波抗原修复，H2O2作用5 min后加Survivin抗体，严格按标准SP步骤进行，过氧化物酶显色。

1.4 结果判定标准

Survivin阳性表达以胞质内是否出现明显的棕黄色颗粒为判断标准。高倍显微镜下观察10个视野计数，计算其阳性表达的百分率。阴性（－）:阳性细胞＜10% ；弱阳性（＋）:阳性细胞≥10%～30%；阳性（⧺）:阳性细胞为＞30%～50%；强阳性（⧻）:阳性细胞＞50%。

1.5 统计学方法

应用SPSS 11.0软件进行统计学分析。采用Chi－square 和 Fisher’s确切概率法进行 χ2检验，相关性采用Spearman等级相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织中Survivin的表达情况

肾盂癌组113例患者肾盂组织中Survivin阳性表达68例，阳性表达率为60.1%，对照组的肾盂组织中阳性表达率为0.0%，2组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；在输尿管癌组 45 例患者中，Survivin 阳性表达25例，阳性表达率为55.6%，对照组Survivin阳性表达率为0.0%，2组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。Survivin 的表达率随着肾盂和输尿管移行细胞癌组织的病理分级、分期的升高而增高（P＜0.05或 P＜0.01）；Survivin 的表达率与性别及年龄无关（均 P＞0.05）。

2.2 随访情况

肾盂癌组113例患者中随访超过1年的有93例，20例失访。93例患者中Survivin阳性者54例，其中24例复发，Survivin阳性者复发率为 44.4%；Survivin阴性者39例，其中10例复发，Survivin阴性者复发率为25.6%，2者复发率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。输尿管癌组45例患者中随访超过1年者有36例，9例失访。36例患者中Survivin阳性者23例，其中复发11例，Survivin阳性者复发率为47.8%；Survivin阴性者13例，其中复发4例，urvivin阴性者复发率为30.76%，2者复发率比较差异有统计学意义（P＜0.05）。肾盂癌组随访超过 5 年者 41例，其中 Survivin 阳性 23 例，5 年生存率为 34.8%（8／23）；Survivin 阴性 18 例，5 年生存率为 55.6%（10／18），2组生存率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。输尿管癌组随访超过5年的19例，其中Survivin阳性11例，5 年生存率为 36.4%（4／11），Survivin 阴性 8 例，5 年生存率为 62.5%（5／8），但 2 组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 尿脱落细胞涂片中Survivin的表达

肾盂癌组25例患者行尿脱落细胞涂片，24例Survivin阳性表达，阳性率为96.0%；输尿管癌组10例患者行尿脱落细胞涂片，Survivin表达均为阳性，阳性率为100.0%；对照组10例患者尿脱落细胞Survivin表达均为阴性。肾盂癌组、输尿管癌组Survivin表达阳性率与对照组比较差异均有统计学意义（均P＜0.01）。尿脱落细胞Survivin检测诊断肾盂和输尿管移行上皮细胞癌的敏感性与特异性分别为 96.0%和 100.0%。

3 讨论

Survivin是1997发现的一种细胞凋亡抑制蛋白，它具有2种功能:抑制细胞凋亡与调节细胞周期，是迄今发现的最强的凋亡抑制因子［2］。Survivin主要通过3种方式直接或间接抑制Caspase活性而抗凋亡［2］，其表达具有细胞周期性，只在G2／M期表达。在大多数恶性肿瘤中都有表达，而在除胚胎期外的正常组织中（胎盘和胸腺除外）均不表达。Survivin与膀胱移行细胞癌关系的研究较多，也有了很大的进展，它的高敏感性和高特异性已引起了泌尿外科医生的注意。本研究中的尿液Survivin蛋白检测为肾盂癌和输尿管癌的诊断提供了一种高敏感性、高特异性和无创的检测指标，其敏感性为96.0%，特异性为 100%［3］。本研究结果表明:Survivin在各级肾盂移行细胞癌和输尿管移行细胞癌中均有不同程度的表达，是判断肾盂移行细胞癌和输尿管移行细胞癌的标志物。

肾盂移行细胞癌和和输尿管移行细胞癌均是泌尿外科的常见疾病，临床症状以全程无痛性肉眼血尿为主，但有时也以腰痛、乏力、发热等为始发症状，即使目前辅助检查多样，但有时仍然很难与肾结核、肾癌、黄色肉芽肿性肾盂肾炎、输尿管结石相鉴别。而膀胱癌患者有膀胱镜检查作为诊断膀胱移行上皮细胞癌的金标准［4］，所以笔者认为对疑有肾脏占位的患者，如果肾盂移行细胞癌的可能性大，但同时又不好与其他占位性病变相鉴别，可以查尿中Survivin的表达，如果Survivin为阳性可以在排除膀胱癌及输尿管移行细胞癌的情况下，诊断为肾盂移行细胞癌，为决定治疗方案提供很好的证据。如果患者输尿管扩张伴实性病变则可以通过CT或MR，辅助检测尿液中Survivin的表达，能及时地发现输尿管移行细胞癌。

肾盂移行细胞癌及输尿管移行细胞癌与Survivin的关系，目前国内外报道甚少。由于肾盂输尿管移行细胞癌与膀胱移行细胞癌起源相同，都是泌尿系移行细胞。近年来虽有一些新的方法可以直接从尿液标本中得出诊断指标，但由于其对Ⅰ级肾盂移行细胞癌存在特异性与敏感性不高的缺陷而未能在临床上推广应用［5］。Survivin是新近发现的一种细胞凋亡抑制蛋白，它具有2种功能:抑制细胞凋亡与调节细胞周期［2］，在大多数恶性肿瘤中都有表达，而在除胚胎期外的正常组织中都不表达（胎盘和胸腺除外）［2］。这种特异性表达使人们把它和恶性肿瘤的诊断联系了起来。本研究结果表明，Survivin在各级肾盂移行细胞癌和输尿管移行细胞癌中均有不同程度的表达，Survivin的表达使移行细胞癌的凋亡受到抑制［6］，对化疗与放疗的抵抗性增强［7］。这些因素是否与肾盂输尿管移行细胞癌的高复发率直接有关还未能明了。本研究结果显示，Ⅲ级肾盂移行细胞癌和Ⅲ级输尿管移行细胞癌组织中Survivin表达均呈强阳性，故认为Survivin与肿瘤细胞的分化程度有关。本研究对10例非泌尿系统肿瘤患者及25例肾盂移行细胞癌患者中尿脱落细胞行Survivin检测，诊断肾盂移行细胞癌的敏感性为96.0%、特异性为100.0%，10例输尿管移行细胞癌中尿脱落细胞Survivin检测诊断输尿管移行细胞癌的敏感性为100%、特异性为100%。因此，这一方法可作为肾盂移行细胞癌和输尿管移行细胞癌的早期诊断及治疗后监测复发的指标，可提高肿瘤细胞的检出率，尤其对Ⅰ级肾盂输尿管移行细胞癌。用Westernblot和逆转录PCR的方法可以测出尿脱落细胞中Survivin的存在，用ELISA方法测定Survivin抗体的浓度来诊断肿瘤，目前也处在实验阶段［8］。从尿脱落细胞涂片中观察Survivin的表达，标本容易收集，采用常规的免疫组化方法即可直接检测到Survivin，方法简单，而且尿液中红细胞与白细胞对本检测无干扰。所以笔者认为，本法作为诊断肾盂输尿管移行细胞癌的筛选方法，但必须要有阴性和阳性对照以减少假阳性和假阴性，特别是Ⅰ级肾盂输尿管移行细胞癌标本中Survivin表达浓度低，如果不重视阴性和阳性对照就会影响检测的准确性。

［1］Brown G A，Matin S F，Busby J E，et al.Ability of clinical grade to predict final pathologic stage in upper urinary tract transitional cell carcinoma:implications for therapy［J］.Urology，2007，70（2）:252－256.

［2］Ambrosini G，Adida C，Altieri D C.A novel anti－apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma ［J］.Nature Med，1997，3（8）:917.

［3］Duffy M J，O’Donovan N，Brennan D J，et al.Survivin:a promising tumor biomarker［J］.Cancer Lett，2007，249（1）:49－60.

［4］Singh R P，Tyagi A，Sharma G，et al.Oral silibinin inhibits in vivo human bladder tumor xenograft growth involving downregulation of surviving［J］.Clin Cancer Res，2008，14（1）:300－308.

［5］Pennati M，Folini M，Zaffaroni N.Targeting survivin in cancer therarpy［J］.Expert Opin Ther Targets，2008，12（4）:463－476.

［6］Wang X L，Hou J Q，Wen D G，et al.Effects of survivin small interfering RNA on biological behaviors of bladder cancer T24 cells［J］.Ai Zheng，2008，27（3）:253－257.

［7］Ma A C，Lin R，Chan P K，et al.The role of survivin in angiogenesis during zebrafish embryonic development［J］.BMC Dev Biol，2007，7:50.

［8］Tian B，Wang Z，Zhao Y，et al.Effects of curcumin on bladder cancer cells and development of urothelial tumors in a rat bladder carcinogenesis model［J］.Cancer Lett，2008，264（2）:299－308.