延迟注射Z-VAD对大鼠局灶性脑缺血神经细胞凋亡及炎症的影响

吴晓冬， 王丽娜， 薄立华， 刘 勇， 朱 辉

脑血管病是严重威胁人类健康的疾病之一，其死亡人数也呈逐年上升的趋势。缺血性脑梗死的病理过程涉及复杂的时间和空间级联反应，虽然对其机制的了解越来越深入，但有效的治疗手段仍然缺乏，仍然迫切需要研究新的治疗方法。

十几年研究表明，脑缺血时，除神经元坏死外，还有另外一种细胞死亡的形式-细胞凋亡，在脑缺血损伤的病理过程中起重要作用。近年来减少脑缺血再灌注损伤后神经元的凋亡一直是治疗脑缺血的热门课题。Caspase是一类半胱氨酸特异性的蛋白酶［1］，其对神经元的凋亡发生起关键作用。而ZVAD-fmk是非竞争性的 caspase抑制剂［2］，为此，我们用延迟注射Z-VAD-fmk治疗大鼠局灶性脑缺血，通过TUNEL染色和ED-1表达检测探讨其对脑缺血的凋亡和炎症的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar大鼠，体重280 ～320g 共60 只，参照 Koizumi［3］和 Longa［4］发明的腔内线栓法制备大鼠大脑中动脉局灶性脑梗死动物模型(MCAo)，1h后拔出尼龙线，使之再通。随机分为Z-VAD-fmk治疗组、生理盐水对照组，每组动物30只。

1.2 主要试剂 Z-VAD(MBL);ED-1单克隆抗体(Serotec);TUNEL试剂盒(Promega)。

1.3 方法

1.3.1 给药方法 在MCAo大鼠脑血流再通半个小时后固定于立体定位仪上，以1μl/min速度侧脑室内泵入 Z-VAD-fmk 70μg/kg(4μl)，缓慢将针退出。对照组用相同体积的生理盐水，注射一次。

1.3.2 分别在MCAo术后第1天、第4天、第7天各处死20只大鼠。用水合氯醛腹腔注射，呼吸降至1～2次/分时暴露心脏，用套管针穿刺左心室，拔出针芯后，将管头置于升主动脉开口处，剪开右心耳，注入冰PBS，待肝脏变白后，灌注4%福尔马林PBS固定液。-20℃放置1h后用咬骨钳咬开颅骨，取出脑标本。选择视交叉水平的脑组织切片，进行HE染色及TUNEL和ED-1免疫组化染色。

1.3.3 脑组织凋亡细胞的原位检测(TUNEL法) 按试剂盒说明书进行，镜下(×400)计数病变侧大脑皮质5个视野中染色阳性细胞数目，取其均值。

1.3.4 ED-1免疫组化染色 按试剂盒说明，第一抗体4℃过夜，生物素标记的第二抗体，室温孵育30min。新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察3～10min，用PBS冲洗，使反应停止。

1.3.5 阳性细胞计数 每组选10例标本，经统计学计算，实验组与对照组的梗死程度没有统计学意义。每例标本在梗死区域的中轴线上，均匀的选取5个高倍视野，计数阳性细胞数，5个区域阳性细胞数的平均值做为一个标本的数据。最后进行统计学计算量化结果。

2 结果

2.1 ED-1免疫组化染色结果 ED-1蛋白是细胞浆中的一种非分泌性蛋白，是巨噬细胞和活化的小胶质细胞的特异性标志，结果显示在MCAo后第4天和第7天对照组与用药组之间差异非常显著(见表 1、图1)。

2.2 TUNEL染色结果 TUNEL染色阳性细胞在MCAo术后第1天即有实验组和对照组间的阳性细胞数的显著差异，第4天和第7天也同样有统计学差异(P ＜0.05)(见表2、图2)。

表1 ED-1阳性细胞计数结果

表2 TUNEL阳性细胞计数结果

3 讨论

脑缺血后再灌注损伤的发病机制较复杂，与自由基的生成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸毒性、线粒体功能障碍、炎症反应、凋亡等一系列因素有关［5］。急性局灶性脑缺血引起的缺血中心区死亡以细胞坏死为主，目前认识的比较清楚，而脑缺血半暗带围绕在坏死区周围，是潜在的可挽救的结构完整脑区［5］。近年来认识到半暗带区域于再灌注数天后出现了迟发性神经元死亡，主要发生在海马、纹状体及皮质区域。而细胞凋亡是神经元迟发性死亡的主要形式，因此，神经细胞凋亡是神经细胞丧失及神经功能损害的重要原因之一。

为此，人们力求寻找能抑制半暗带细胞凋亡的方法来治疗脑缺血，以抑制或减少迟发性神经元凋亡的发生，挽救半暗带内神经元。已经明确凋亡存在着3条细胞信号传导途径，分别是死亡受体途径、线粒体途径及内质网途径。最经典的是细胞内外各种死亡信号可诱导线粒体释放Cyto-c，Cyto-c再与Apaf-1结合，使 Apaf-1发生构象改变。再与 procaspase-9结合，形成 Cyto-c Apaf-1 procaspase-9即“凋亡小体”(apoptosome)，从而使procaspase-9活化并激活下游其他 caspase［6～8］。但无论哪一条途径都有 caspase的密切参与，完成凋亡过程。而 ZVAD-fmk(N-benzyloxycarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethyl ketone)是一种非选择性的不可逆性的细胞通透性肽类caspases抑制剂，通过与caspases氟甲烷酮(FMK)基团发生不可逆结合而发挥作用。ZVAD-fmk作用广泛，是广谱caspases抑制剂。应用Z-VAD-fmk可阻断细胞凋亡，提高细胞存活率。2000年Huang等［9］首次发现，在缺血发作后应用ZVAD-fmk可以有效缩小缺血/再灌注损伤所造成的大鼠心肌梗死范围。我们选择延迟注射caspase抑制剂Z-VAD-fmk治疗大鼠局灶性脑缺血，使之更符合临床，观察其对凋亡和炎症的影响。

首先对病理标本进行了TUNEL染色，结果显示在MCAo术后第1天即开始有凋亡阳性细胞的减少，而且在用药组和对照组之间有显著差异，说明在脑缺血的急性期，Z-VAD-fmk已开始发挥作用，而且贯穿脑缺血从第1天到第7天都有效果，皆显示用药组和对照组的明显差异。

炎性反应是脑梗死的一个重要病理变化过程，它在脑梗死中的作用逐渐被学者所重视，那么，Z-VAD-fmk抑制了caspase，即抑制了凋亡的发生外，对炎症是否有影响呢?因为与脑缺血炎症反应关系密切的炎症细胞主要有白细胞与单核-巨噬细胞［10］。在脑梗死的早期(1d以内)中性粒细胞就开始浸润，持续3d左右，即消失;从梗死后3d开始，巨噬细胞大量出现在损伤区域，一直持续到梗死后3w或更长。它的作用开始被认为主要是清理损伤区域，帮助损伤区域尽快恢复，近年来，随着研究的不断深入，发现过高水平的炎性反应会加重脑损伤，扩大损伤面积，只有适度的炎性反应对于脑损伤才是有益的，通常脑梗死的炎性反应水平都是过高的，是对脑组织不利的。许多学者证实在脑梗死后降低炎性反应水平，抑制巨噬细胞浸润，可减少梗死面积。为此，我们采用ED-1抗体对标本进行了免疫组织化学染色。ED-1是细胞浆中的一种非分泌性蛋白，是巨噬细胞和活化的小胶质细胞的特异性标志，结果显示在MCAo后第4天和第7天对照组与用药组之间差异非常显著。本实验结果提示在脑室内延迟注射caspase抑制剂Z-VAD-fmk后，ED-1阳性细胞数明显少于对照组，这说明Z-VAD-fmk可以抑制炎性反应。

由此说明，延迟注射Z-VAD-fmk可对脑缺血有神经保护作用，它的作用途径是多方面的，其中抑制炎性反应和细胞凋亡是两个重要方式。

图1 ED-1染色(DAB显色×400)(箭头所示阳性细胞);(A):Z-VAD-fmk治疗1d(B):Z-VAD-fmk治疗4d;(C):Z-VAD-fmk治疗7d;(D):对照1d;(E):对照4d;(F):对照7d

图2 TUNEL染色(DAB显色×400)(箭头所示阳性细胞);(A):Z-VAD-fmk治疗1d(B):Z-VAD-fmk治疗4d;(C):Z-VAD-fmk治疗7d;(D):对照1d;(E):对照4d;(F):对照7d

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