CD147、MMP-9与釉质型颅咽管瘤侵袭性生长及复发的相关性研究

田继辉， 夏志强， 刘仲涛， 高海晓， 刘文庆

颅咽管瘤是颅内常见的先天性肿瘤(约占颅内肿瘤的4%)，在儿童中占幕上肿瘤的第一位［1］。颅咽管瘤虽属良性肿瘤，但易于复发。有报道，手术治疗颅咽管瘤，病死率高达 38%［2，3］，复发率高达58%［4］。特别是儿童釉质型颅咽管瘤，以囊性为主，与下丘脑粘连紧密，术后复发率明显高于以实质性为主的成人鳞状乳头型颅咽管瘤。目前关于颅咽管瘤复发的生物学机制研究甚少，有报道部分颅咽管瘤向毗邻脑组织呈绒毛状浸润性生长［5］，而肿瘤侵袭性生长的特性无疑与术后肿瘤细胞残留、复发密切相关。

CD147又名细胞外基质金属蛋白酶诱导因子，可诱导肿瘤细胞及周围间质纤维细胞分泌MMPs，促进细胞外基质和基底膜的降解，导致肿瘤细胞的浸润与转移［6］。基质金属蛋白酶(Matrix Metal Proteinases，MMPs)是一系列蛋白水解酶，在肿瘤侵袭和复发过程中发挥着重要作用。特别是MMP-9，又称为IV型胶原酶或胶原酶B，其主要作用底物为IV型胶原。MMP-9是MMPs家族的重要成员之一，通过降解IV型胶原促进细胞外基质重塑并破坏基底膜以促进新生血管形成［7］。本文旨在探讨CD147和MMP-9在釉质型颅咽管瘤中的表达及其与釉质型颅咽管瘤侵袭性生长的和复发的关系。

1 材料与方法

1.1 临床资料 40例釉质型颅咽管瘤标本2007年12月～2009年12月取自北京天坛医院神经外科，原发组24例(原发组纳入标准为:第一次手术，没有进行放疗和化疗，肿瘤全切，术后一年内，核磁共振复查，鞍区未见肿瘤发生);复发组16例(复发组纳入标准为:第一次手术，没有进行放疗和化疗，肿瘤全切，术后一年内，核磁共振复查，鞍区有明确肿瘤发生)。其中男18例，女22例;患者年龄-分布1～18岁，平均8.5岁。肿瘤标本取材后甲醛固定、石蜡包埋后做HE染色组织学分型及免疫组化染色。所有标本均经病理科医师确诊为釉质型颅咽管瘤。

1.2 方法、试剂及设备 免疫组织化学法步骤:将釉质型颅咽管瘤石蜡标本制成4μm厚切片，常规二甲苯脱蜡、酒精水化后，浸入3%H2O2溶液中，室温下孵育10min，蒸馏水冲洗干净后，电炉或者水浴锅加热0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液(pH 6.0)至95℃左右，放入切片加热10～15min;滴加正常山羊血清封闭液室温封闭20min;分别滴加兔抗人CD147单克隆抗体，兔抗人MMP-9单克隆抗体在37℃恒温箱中孵育2h。经磷酸盐缓冲液PBS冲洗3次各5min后，滴加生物素标记的二抗体，DAB显色，苏木精复染，脱水透明封片。以相应的乳腺癌肿瘤标本染色作为阳性对照，以磷酸盐缓冲液代替一抗染色作为阴性对照(本试验所用试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。TE2000-U倒置生物显微镜(日本Nikon公司)。

1.3 结果判定标准 CD147蛋白表达主要位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞浆上，呈棕黄色或黄褐色颗粒为阳性，MMP-9以细胞质和细胞膜出现棕黄色或黄褐色颗粒为阳性。在高倍视野(×400)下，每张切片随机观察5个视野的肿瘤细胞，计算200个肿瘤细胞免疫反应阳性的细胞百分比，根据半定量免疫组织化学方法，对CD147及MMP-9反应细胞显色强度及范围进行评价:(1)阴性(-):无阳性细胞染色;(2)弱阳性(+):阳性细胞小于25%或显色浅;(3)中度阳性(⧺):阳性细胞在26% ～50%或染色略深;(4)强阳性(⧻):阳性细胞大于50%或显色深。

1.4 统计学分析 比较原发组/复发组相应数据，应用SPSS软件(13.0)进行Mann-Whitney检验分析与Sprerman检验分析，P＜0.05。

2 结果

2.1 免疫组化显色结果 CD147蛋白表达主要位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞浆上，在间质中的成纤维细胞上也有少量表达，MMP-9主要以胞浆表达为主，并伴有胞膜表达，呈黄褐色颗粒，同时MMP-9在复发肿瘤中的连续表达主要集中与栅栏状细胞的底部，而原发组的表达则不连续。结果表明:在复发组和原发组釉质型颅咽管瘤中CD147的总阳性表达率分别为87.5%和37.5%，复发组中CD147的表达变化明显高于原发组，具有统计学差异(Z=-2.784，P＜0.05)。复发组和原发组釉质型颅咽管瘤中MMP-9的总阳性表达率分别为93.7%和41.7%，复发组中MMP-9的表达变化明显高于原发组，具有统计学差异(Z=-3.367，P ＜0.05)(见表1)。

2.2 相关分析 Sprerman分析显示:复发组釉质型颅咽管瘤中CD147与MMP-9表达呈正相关(r=0.652，P ＜0.01)，原发组釉质型颅咽管瘤中CD147与MMP-9表达无明显相关性(P＞0.05)。

表1 CD147与MMP-9与在复发/原发釉质型颅咽管瘤中的表达情况及对比

3 讨论

颅咽管瘤的易复发倾向，与肿瘤呈侵袭性生长密切相关。Kawamata T等［8］报道颅咽管瘤虽属良性肿瘤，但部分肿瘤边界不清，肿瘤组织呈“指样”突入毗邻正常脑组织，从而导致单纯显微手术难以全切肿瘤，术后易于复发。鉴于此，研究与该肿瘤侵袭性生长、复发密切相关的生物学标记物，期望能提前判断肿瘤的侵袭性和复发倾向，从而为术前个体化治疗方案的制定及术后肿瘤复发的早期预警提供客观依据。

人CD147亦称细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)，属免疫球蛋白超家族成员。其主要功能为参与细胞-细胞或细胞-基质的粘附，同时具有刺激肿瘤细胞及周围间质成纤维细胞产生基质金属蛋白酶，从而进一步降解细胞外基质型胶原，促进肿瘤细胞的局部浸润［9］。有研究报道在胶质瘤、骨巨细胞瘤、泌尿系肿瘤、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中均有CD147表达增强的出现［10］。在部分肿瘤中还发现随着肿瘤恶性程度的增高，CD147表达也随之增多，且与肿瘤的浸润和转移相关［11，12］。本研究对CD147在釉质型颅咽管瘤中的表达进行研究，结果显示:CD147蛋白表达主要位于肿瘤细胞的细胞膜和细胞浆上，在间质中的成纤维细胞上也有少量表达。复发组和原发组釉质型颅咽管瘤中CD147的总阳性表达率分别为 87.5%和 37.5%，复发组中CD147的表达变化明显高于原发组，具有统计学差异(Z=-2.784，P ＜0.05)。CD147 高表达的病例，肿瘤与毗邻下丘脑结构粘连紧密，表明CD147蛋白在釉质型颅咽管瘤的表达上调，并且其表达率与釉质型颅咽管瘤的侵袭和复发有关，随着肿瘤的粘附，侵袭和复发的比例增高，CD147蛋白的表达率也逐步增加，提示CD147与釉质型颅咽管瘤的浸润性生长密切相关。

MMP-9属于IV型胶原酶，通过降解细胞外基质和破坏基底膜中Ⅳ胶原，促进了肿瘤突破包膜，向毗邻结构浸润和转移［13］。以往的研究发现，MMP-9与垂体瘤的侵袭性密切相关，常常导致肿瘤的侵袭性生长和复发［14］。本研究对MMP-9在釉质型颅咽管瘤中的表达进行研究，结果显示:MMP-9表达的部位主要位于胞浆，同时伴有胞膜染色，其在复发釉质型颅咽管瘤中的总阳性表达率93.7%，明显高于原发组的41.7%(Z=-3.367，P ＜0.05)。MMP-9 高表达的病例，肿瘤与毗邻下丘脑结构粘连紧密，且即便肿瘤镜下全切，术后一年内复发率明显高于MMP-9低表达的病例。因此，MMP-9可能成为判断釉质型颅咽管瘤侵袭性和复发倾向的生物学指标。

本研究发现复发组肿瘤CD147和MMP-9总阳性表达率明显升高，该组肿瘤多呈指状或旋涡状突入毗邻脑组织，之间无明确的包膜分隔，与原发组肿瘤包膜相对完整，形态学上有较显著不同。由此，进一步提示，CD147和MMP-9的高表达与釉质型颅咽管瘤的侵袭性生长、复发关联紧密。本研究发现，在复发组釉质型颅咽管瘤中CD147蛋白与MMP-9蛋白常同时表达，二者相关系数(r=0.652，P ＜0.01)表明在复发组中CD147与MMP-9的表达呈正相关，提示CD147确能促进MMP-9的产生。原发组中的表达无明显相关性，可能是CD147刺激MMP-9的分泌未达到一定“阈值”范围区间。同时可能反映MMP-9的产生不仅与CD147有关，尚与其他因素有关。有学者认为，MMP-9的表达与活性与血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子(TGF)等多种活性递质有关［15，16］，本文亦赞同这一观点。

综上所述，本研究结果表明CD147、MMP-9在釉质型颅咽管瘤侵袭、复发过程中发挥了重要作用，可能成为评价颅咽管瘤术后复发倾向的潜在生物学指标。在临床诊治过程中，可通过检测肿瘤组织CD147、MMP-9表达强度的变化趋势，在肿瘤全切的基础上评估复发风险指数，为釉质型颅咽管瘤的诊治及改善预后提供帮助。

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