一株马鼻疽诺卡菌临床分离株的鉴定*

李晓亮,张媛媛,赵 平,赵秀芹,陈 祥,焦新安,万康林

2.扬州大学,江苏省人兽共患病重点实验室,扬州225009;

3.北京市朝阳区疾病预防控制中心结核病防治所,北

有些诺卡菌(Nocardia)与非结核分枝杆菌(Non-tuberculosis Mycobacterium,NTM)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的肺结核病的临床表现极为相似,容易造成误诊,且存在混合感染[1-3]。然而,传统通过表型和生化鉴定菌种的方法耗时费力很难满足临床准确快速鉴定病原菌的需要。现代分子生物学技术,尤其是PCR和DNA测序技术为发展诺卡菌快速菌种鉴定技术提供了良好基础。本研究通过对16S rDNA基因和rpoB基因的PCR扩增产物测序后,在NCBI中进行同源性比对,将表型确定为非结核分枝杆菌的BJ7临床分离菌株确定为马鼻疽诺卡菌(Nocardia f arcinica,N.f arcinica)。

1 材料与方法

1.1 菌株 临床分离菌株BJ7由朝阳区疾病预防控制中心结核病防治所提供,来自一拟诊结核病患者痰标本;H37Rv购自中国生物制品药品检定所;均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病研究室传代培养、保藏。均按给定方法接种培养,判定结果[5]。马鼻疽诺卡菌AY756551取自NCBI。

1.2 主要试剂 L-J培养基中国疾病预防控制中心传染病预防控制所结核病研究室制备[4]、PNB/TCH分枝杆菌鉴别培养基购自倍索公司。引物由上海生工合成,2xPCR-mix购自天根公司。

1.3 DNA提取 CTAB法提取[8]菌株DNA。生理盐水收集临床菌株新鲜培养物50～100mg(湿重),用溶菌酶,10%SDS/蛋白酶K混合液及CTAB破除细胞壁,去除蛋白,脂类等物质,然后用氯仿萃取,冰乙醇洗涤 DNA沉淀,最后用TE溶解DNA沉淀,-20℃保存备用。

1.4 rpoB、16S r DNA PCR扩增、测序分析 引物序列见表 1。 PCR 反 应 体 系 为 50μ L:引 物 各 2.0μ L,PCR-mix 25μ L,样品 DNA 5μ L,纯水 16μL。rpoB PCR 和 16SrDN A PCR反应条件相同:94℃10min;94℃ 1min,62℃ 1min,72℃1min,30次循环;72℃10min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳40min,EB染色20min后,紫外灯下观察结果。

1.5 DNA测序分析 PCR扩增产物均由擎科公司测序。将16S rDNA测序序列与GenBank中诺卡菌16S rDNA参考序列(登录号见fig.1)应用DNASTA R软件进行多序列比对,并用MEGA 4.0绘制生物进化树。同时将16S rDNA和rpoB基因序列提交NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)进行同源性比对。

表1 rpob,16S rDNA引物序列、目的片段、Tm值表Table 1 Premiers,product sizes and Tm of,rpoB and 16S rDNA gene

2 结 果

2.1 培养鉴定 BD培养管第7d报告阳性。普通L-J培养基37℃培养10d左右就可以生长出微黄色菌落,接种鉴别培养基 PNB和 TCH,可见菌落生长,痰涂片抗酸染色可见暗红色杆状菌体,鉴定为非结核分枝杆菌。

2.2 rpoB和16SrDNA PCR扩增 rpoB和16S rDNA PCR扩增产物大小分别约360bp和1 000bp。

2.4 测序分析 对rpoB和16SrDNA PCR产物测序,与公共数据库(GenBank database,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)作DNA序列同源性比较,结果与马鼻疽诺卡菌的该片段相似性高,同源性分别为99%和100%,见表2。对16SrDNA序列与诺卡菌标准序列进行多序列比对分析,BJ7与AY756551(N.f arcinica)匹配度最高,进化树中与N.f arcinica亲缘关系最近,见图 1。

3 讨 论

诺卡菌可以引起人的多种感染性疾病。对人类致病的主要有星形诺卡菌,巴西诺卡菌、豚鼠诺卡菌及鼻疽诺卡菌。其中马鼻疽诺卡菌可以起引起人脑脓肿[10],肝脏移植感染[11],人的呼吸道和皮肤感染[12]。1888年,兽医 Edmond Nocard首先从牛身上分离出诺卡菌[14]。一年后,Trevisan研究了它的特性并命名为马鼻疽诺卡菌(Nocardia farcinica)[13]。1975年被认定为人类致病菌[19-20]。Valenzuela Tovar JF等人报道曾经从结核病患者痰液中分离到12株诺卡菌[15]。西班牙学者曾报道由马鼻疽诺卡菌引起的肺部感染[14]。据报道对甲氧苄氨嘧啶,利福平,卡那霉素等多种抗生素具有耐药性[17-18]。鉴于马鼻疽诺卡菌是引起人类严重疾病的常见诺卡菌,并且具有高度的耐药性,临床实验室有必要将马鼻疽诺卡菌从诺卡菌中鉴别出来[13]。

表2 NCBI上blast比较rpoB和16SrDNA基因扩增产物DNA序列同源性Table 2 BLASTN of test strains about rpoBand 16SrDNA on NCBI

本实验菌株BJ7从呼吸道拟诊结核病患者痰液中分离到。通过表型和生化疑似鉴定为为非结核分枝杆菌,分子生物学鉴定是马鼻疽诺卡菌。说明马鼻疽诺卡菌在生长和形态上的特点与非结核分枝杆菌相似,临床上肺部诺卡菌病与肺部分枝杆菌病症状相似,容易引起误诊,因此,准确进行菌种鉴定非常重要。病原菌传统的分类、鉴定系统主要以形态和生理生化特征的综合指标为依据,易受多种因素影响,鉴定结果存在着很大的异质性,有时不可靠性不强,而且鉴定一种菌种费时、低效,不能难以满足临床需求。随着分子生物学技术的发展,许多技术被应用于菌种鉴定比如,如DNA测序、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism analysis,RFLP)[9]。2006年Nava,V.R[7]等人应用hsp65-RFLP鉴定诺卡菌菌种,成功鉴定出北京诺卡菌(N.beijingensis)、马鼻疽诺卡菌(N.f arcinica)、南非诺卡菌(N.transvalensi)等8种诺卡菌。虽然此方法现在被广泛应用于菌种鉴定,但仍不能满足实际需求,许多菌种指纹图谱比较相近难以区分仍需要测序的方法进行鉴定,16S rDNA直接测序仍然被广泛应用于菌种鉴定[6,16]。本次实验通过16S rDNA进化树分析结果发现BJ7菌株与马鼻疽诺卡菌的亲缘关系很近,将序列提交NCBI进行BLAST比对结果BJ7与马鼻疽诺卡菌同源相似性达到100%,rpoB基因序列比对相似性达到99%,证实BJ7为马鼻疽诺卡菌。直接测序分析能够将诺卡菌鉴定到种的水平,快速、敏感、准确、简便。

图1 16SrDNA序列相似性进化树注:进化树所用序列除BJ7 16SrDNA外均来自Gen Bank中的参考序列,菌株名后面的分别是菌株保藏库编号和序列登录号。箭头所指方框中所标注的是与BJ7 16S rDN A序列亲缘关系比较近的菌株。Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences homologyPhylogenetic tree showing the position of BJ7 and N. farcinica (GenBank accession number AY756551)marked by arrow within other Nocardia species.The tree was based on 16S rDN A comparison(1000bp)usingthe neighbor-joining method from MEGA 5.0 software.All sequences used in phylogenetic tree were obtained from GenBank besides BJ7 and the accession numbers were presented behind the species name.

在临床实际诊断过程中,对于那些拟诊结核病的患者,若用结核分枝杆菌治疗方法治疗不见好转,可以考虑是否是诺卡菌感染,应对病原菌进行种的坚定,为临床治疗提供参考。

[1]Stein L,Estrellado RE,Judd JM,et al.Nocardiosis and tuberculosis.Report of a case of coexistent pulmonary tuberculosis and extrapulmonary nocardiosis[J].Thorac Cardiovasc Surg,1962,43:314-319.

[2]Helal ZH,Khan MI,Eissa SA,et al.Detection and Characterization of Nocardia from Patients Diagnosed as Tuberculosis in E-gypt[J].International Journal of Biomedical Science,2008,4(3):179-184.

[3]Chaudhury RC,Aher AR,Rastogi V,et al.A case of mixed pulmonary infection by nocardia and Mycobacterium tuberculosis[J].Indian J Pathol Microbiol.2009 52(2):294-295.

[4]张敦熔.现代结核病学[M].北京:人民军医出版社,2000.:16-17.

[5]张敦熔.现代结核病学[M].北京:人民军医出版社,2000:21-22.

[6]Kirschner P,Meier A,Bo¨ttger EC.Genotypic identification and detection of mycobacteria:facing novel and uncultured pathogens[M].In D.H.Persing,F.Tenover,T.J.White,and T.F.Smith(ed.),Diagnostic molecular microbiology.American Society of Microbiology,Washington,D.C.1993:173-190.

[7]Nava VR,Couble A,Devulder G,et al.Use of PCR-restriction enzyme pattern analy sis and sequencing database for hsp65 genebased identification of Nocardia species[J].Clin Microbiol,2006,44(2):536-546.

[8]Embden JD,Cave MD,Crawford JT,et al.Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting:Recommendations for a standardized methodology[J].Clin Microbiol,1993,31(2):406-409.

[9]Telenti A,Marchesi F,Balz M,et al.Rapid identification of mycobacteria to the species level by polymerase chain reaction and restriction enzyme analysis[J].Clin Microbiol,1993,31(2):175-178.

[10]T atti KM,Shieh WJ,Phillips S,et al.Molecular diag nosis of Nocardia f arcinica from a cerebral abscess[J].Human Pathology,2006,37(8).

[11]Shin N,Sugawara Y,T sukada K,et al.Successful treatment of disseminated Nocardia farcinica infection in a living-donor liver transplantation recipient[J].T ransplant infectious disease,2006,8(4).

[12]Torres OH,Domingo P,Pericas R,et al.Infection caused by Nocardia farcinica:case report and review[J].European journal of clinical microbiology&infectious diseases,2000,19(3).

[13]黄景明.诺卡菌分类及临床意义[J].卫生职业教育,2005,23(15).

[14]Torres OH,Doming o P,Pericas R,et al.Infection caused by Nocardia farcinica:case report and review[J]Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2000,19(3):205-12.

[15]Valenzuela TJF,Contreras Perez C,Shibayama Hernandez H,et al.Biochemical identification and molecular characterization(PCR-RFLP)of Nocardia isolates from sputum[J].Archives of Medical Research,2005,36(4).

[16]Kirschner P,Springer B,Vogel U.Genotypic identification of mycobacteriaby nucleic acid sequence determination:report of a 2-year experience in aclinical laboratory J[J].Clin Microbiol,1993.31:2882-2889.

[17]Hitti W,Wolff M.Two cases of multidrug-resistant Nocardia farcinica infection in immunosuppressed patients and implications fo r empiric therapy[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2005,24(2):142-144.

[18]Ishikawa J,Yamashita A,Mikami Y,et al.T he complete genomic sequence of Nocardia f arcinica IFM10152[J].Proc Natl A cad Sci USA,2004,101:14925-14930.

[19]Beaman BL,Saubolle MA,Wallace RJ,et al.Nocardia,Rhodococcus,Streptomyces,Oerskovia and other actinomycetes of medical importance.In:Murray PP,Baron EJ,Pfaller MA,Tenover FC,Yolken RH(eds)[M]Manual of clinical microbiology.American Society for Microbiology,Washington,DC,1995:379-399.

[20]Holm P,Seven cases of human nocardiosis caused by Nocardia f arcinica[J].Sabouraudia,1975,13:161-169.