鸡源性肠炎沙门氏菌的流行病学调查*

王 亮,张元鹏,张荣武,徐 彪,朱来华,肖西志,罗 欣,常维山

2.山东省检验检疫技术中心,青岛 266002;

3.山东省德州市陵县畜牧局,德州 253500

沙门氏菌是重要的肠道致病菌,是一个很大的菌属,其血清型超2 000个,我国已发现216个[1-2]。肠炎沙门氏菌是其中的一种,常可引起鸡、鸭等禽类感染,更重要的是可引起食物中毒。据报道,日、美等发达国家发生的食物中毒事件中40%～80%是由禽沙门氏菌引起的,其中主要病原菌为肠炎沙门氏菌[3]。我国针对于鸡感染肠炎沙门氏菌的报道不多,为了解我国鸡群及鸡产品是否有肠炎沙门氏菌及其感染的情况,我们进行了鸡源性肠炎沙门氏的分离鉴定及全国血清学调查,现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料来源 为2008年以来我校兽医门诊就诊的病、死雏鸡的肝脏或心脏。

1.2 细菌分离、鉴定 取病死鸡的心脏、肝脏等脏器直接在DHL培养基上划线分离,恒温箱中37℃培养24h。选取中间黑色边缘半透明的小菌落,再在麦康凯培养基上划线分离。挑取无色透明的可疑菌落,进行纯培养。取分离及纯化培养的细菌,进行涂片、染色、镜检。

1.3 生化鉴定 参考以往的文献做了如下生化试验[3-4],在三糖铁培养基上表面上进行划线与并穿刺培养,同时接种葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、枸橼酸铵盐、V-P试验 、吲哚、乳糖 、蔗糖 、硫化氢、尿素等微量发酵管进行生化试验。

1.4 血清学鉴定 按照沙门氏菌诊断血清(60种)说明书(宁波天润生物药业有限公司),将临床所分离的可疑沙门氏菌的培养物与沙门氏菌属诊断血清进行凝集试验,10min内出现凝集者为阳性。

1.5 PCR

1.5.1 16s和23s rRNA扩增与测序 用CTAB法[5]提取可疑肠炎沙门氏菌的DNA基因组,根据已发表的肠炎沙门氏菌16s和23s rRNA以及其他的文献[6-7]设计特异性引物,对分离的可疑肠炎沙门氏菌进行PCR扩增。引用16s rRNA引物[8]P1:TCACGACTTACATCCTAC; P2: CTGCTATATCAGCACAAC。扩增的目的片段的长度为697bp。23s rRNA引物序列为 P1:CGGGGGTAGAGCACTGTT T; P2: GGT TTGGGGTACGAT TTGA。扩增的目的片段的长度为761bp。反应体系为:10×PCR Buffer 2.5μ L;25mmol/L MgCl2,2μ L;10mmol/L dNTPs 0.5 μ L;上下游引物各0.5μ L;Taq 酶 0.2μ L;灭菌三蒸水 18.3μ L;模版 0.5μ L。16S rRNA 反应条件为:94℃10min,94℃45s,52℃45s,72℃1min,72℃延伸10min,30个循环。23S rRNA反应条件为:94℃10min,94℃45s,57℃45s,72℃1min,30个循环,72℃延伸min。

1.5.2 热激蛋白60(HSP60)序列的扩增 根据肠炎沙门氏菌P125109MOPA序列中的HSP60序列,设计一对引物 P1:CGCGACCGTACTGGCGCAG;P2:AACAGCAGCCACT TTCACGATG。扩增片段为556bp反应体系同上。反应条件为:94℃10min,94℃30s,60℃30s,72℃30s,72℃延伸7min,30个循环。

1.6 人工感染试验 将所分离的肠炎沙门氏菌接种于5mL试管中,37℃震荡过夜培养。对菌液稀释至0.5麦氏浓度,接种于 1d的SPF雏鸡5只,每只灌服300μ L,对照组不接种。从死亡的鸡只中分离细菌,进行细菌学鉴定。

另接种1d龄商品蛋雏鸡(海兰褐公雏,购自泰安东岳种鸡场),分组:将20只雏鸡分成4组,1,2,3组分别按照1∶100、1∶1 000、1∶10 000比例稀释,每只灌服300μ L菌液,第4组灌服300μ L生理盐水作对照试验。每1d观察发病与死亡情况。

1.7 肠炎沙门氏菌凝集试验

1.7.1 肠炎沙门氏菌凝集抗原的制备 参照有关文献[9-11]将试验步骤加以改进。①将分离株接种于LB肉汤,置37℃震荡培养24h。用灭菌的生理盐水洗涤2次,然后调节菌液浓度与3号麦氏比浊管相当(大约1×1010/mL)②菌液灭活:按菌液体积的0.6%加入甲醛溶液,置37℃震荡孵育24h,然后做无菌灭活试验确定细菌都被灭活。③抗原染色:将灭活的抗原按3%加入结晶紫染色液进行染色,充分摇匀,室温放置48h。置4℃冰箱保存备用。

1.7.2 凝集试验 根据参考文献[6,9]进行凝集试验。将攻毒的实验鸡只进行无菌采血。各吸取50μ L,与凝集抗原混合均匀,观察凝集现象。

1.7.3 交叉试验 用自制的凝集抗原与鸡白痢沙门氏菌的阳性血清进行玻片凝集试验,采集接种肠炎沙门氏菌的鸡血,制备简易的阳性血清与鸡白痢凝集抗原进行玻片凝集试验。

1.8 血清流行病学调查 本实验室主要从山东、江苏、安徽、河南、河北以及其他的一些省份,采集各个日龄的商品蛋鸡血样共计603份,分别进行玻片凝集试验。从当地3个农贸市场采集四喜丸子1份,猪场1份,鱼1份,鸭翅 1份,鸭爪1份,鸭肠1份样品中分离细菌鉴定有无肠炎沙门氏菌污染。

1.9 药敏试验 对分离的两株细菌,进行药敏试验测其MIC值。选取临床常用的丁胺卡那、头孢曲松、哌拉西林、阿莫西林和克拉维酸钾、阿奇霉素、头孢哌酮、克林沙星、粘杆菌素、土霉素、多西环素、痢菌净、磷霉素、新霉素13种药物,将初始浓度定为8 192μ g/mL。将细菌接种到3ml～5ml营养肉汤中,于37℃恒温振荡培养8h～10h。用麦氏比浊管调至0.5麦氏浓度。采用倍比稀释法,测定单药的MIC[12]。

2 结 果

2.1 细菌分离鉴定 根据培养特性和形态学特征,自11株份可以病料中,分离出3株可疑肠炎沙门氏菌。即sd1,sd2,sd3。

2.2 生化反应 三糖铁培养基呈红色,上层段为黄色,产生H2S,使培养基变黑。生化试验结果见表1。

由表1可见该菌葡萄糖(+)、麦芽糖(+)、吲哚(-)乳糖(-)蔗糖(-)硫化氢(+)、尿素(-)、山梨醇(+)。枸橼酸铵盐(-)甘露醇(-)、V-P试验(-)。

2.3 3株可疑菌株的血清鉴定结果 1号菌,O3,19(+);Hg,p(+);Hg(+);Hm(+),抗原式:3,9:g,p,m。2、3号菌相同,结果为,O3,19(+);O9(+);Hg,p(+);Hg(+);Hm(+),抗原式:3,9,19:g,m,p。1号菌根据考夫曼·怀特沙门氏菌属抗原表鉴定为库卡沙门氏菌,2、3号菌根据O9阳性判断其为肠炎沙门氏菌[13]。选择3号菌进行后续试验。将3号菌命名为S.enteritidis SD3。

表1 临床分离菌与肠炎沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌的生化试验比较Table1 The comparison of biochemistry test among clinical strains,Salmonella enteritidis and Salmonella pullorum

2.4 PCR扩增 提取分离菌S.enteritidis SD3分离株染色体DNA,用设计的特异性引物扩增。扩增产物经0.8%浓度的琼脂糖凝胶电泳。结果如图1。图1-A显示,扩增出的目16s rRNA的片段长度约679bp与设计长度相同。图1-B显示,扩增出的23s rRNA片段长度约761bp与设计长度相同。图1-C显示,扩增出的 HSP60片段与设计长度558bp相同。

选取分离菌的经DNA测序和序列分析,表明该菌16s rRNA序列与鸡肠炎沙门氏菌(序列号:AM933172)16s rRNA序列完全相同。23s rRNA序列与鸡肠炎沙门氏菌(序列号:EU146953)23s rRNA序列100%相同。HSP60与AM933172序列同源性为100%。与鼠伤寒沙门氏菌同源性分别为99%(序列号:CP001363)。

2.5 攻毒结果 人工接种4d后,SPF小鸡开始发病,5d死亡2只,6d死亡1只,7d死亡2只(总死亡率:100%)。从死亡的鸡只中分离的细菌,与上述鉴定结果相同。商品蛋雏鸡:三组6d死亡1只;7d死亡1只;第12d第 1、2组各死亡 1只(总死亡率:4/15)。采集11只幸存的攻毒实验鸡血清,7只凝集试验阳性,阳性率63.6%。

图1 PCR结果Fig.1 PCR product

2.6 交叉试验结果 对肠炎沙门氏菌与鸡白痢沙门氏菌的交叉免疫学试验,显示两者虽属于D群沙门氏菌,但是并没有出现凝集现象,结果为阴性。

2.7 流行病学调查 用自制的凝集抗原与采自攻毒鸡只的血清进行玻片凝集试验,除对照组外,其余均发生凝集现象。对全国603份血样进行的检测,共有9份为阳性,其中2份强阳性。8株可疑沙门氏菌株均不能与肠炎沙门氏菌株阳性血清出现阳性凝集反应。

2.8 药敏试验结果 S.enteritidis SD3的MIC值为哌拉西林 64μ g/mL,丁胺卡那为 16μ g/mL,头孢曲松为8μ g/mL,阿莫西林和克拉维酸钾是125μ g/mL,阿奇霉素 16μ g/mL,头孢哌酮 8μ g/mL, 克林沙星 4μ g/mL,粘杆菌素 64μ g/ml,多西环素 8 192μ g/ml,土霉素 256μ g/mL,磷霉素 512μ g/mL,痢菌净16μ g/mL,新霉素256μ g/mL 。

3 讨 论

3.1 本研究所用病料是从我校兽医门诊就诊的病鸡体内收集的,分离出到的2株沙门氏菌不能反应肠炎沙门氏菌的感染率,仅表明目前国内确有肠炎沙门氏菌感染。从我们试验看,攻毒的鸡只死亡率较低。试验组鸡只相对于对照组,采食量虽无明显变化,但身体瘦小,拉稀粪这与其肠毒素作用有密切相关[14-18]。但是对SPF鸡的致死率较高(死亡率:5/5),SPF鸡的发病性较严重,可能与其饲养环境较好,与病原微生物不接触,也可能与肠道微生态有关。

3.2 交叉试验的结果显示,本实验室分离的这两株菌与鸡白痢沙门氏菌未见到明显交叉凝集的现象,虽然这两种细菌同属于D群,可能存在这种交叉现象,但就本实验室分离的菌来说,这种现象可以不被考虑。

3.3 在我们目前所做的流行病学调查表明,肠炎沙门氏菌流行还不像鸡白痢那样较为普遍,600多份的血清样品检出9份阳性,说明肠炎沙门氏菌在鸡群中感染仍还不普遍。当然,这一调查主要是准对与蛋鸡群的样本检测,至于其他鸡群的情况,现在还不了解。

3.4 本实验室从市场购买的禽类制品中没有分离到肠炎沙门氏菌,这也证明了禽肉制品被其污染的几率很低。针对感染率较低的情况,这是可能由于我国在蛋鸡饲养过程中,经常使用定期使用抗菌药物,因此规模化养鸡场沙门氏菌感染并不严重(在本研究进行的同时,我们同时进行了鸡白痢沙门氏菌血清学调查,阳性率低于1%),因此本研究所进行的肠炎沙门氏菌的血清学调查发现阳性病例较少。

3.5 同时对这两株菌进行了药敏试验该菌对丁胺卡那、头孢曲松、哌拉西林均敏感。这就可能是我国目前肠炎沙门氏菌未大面积流行的原因。

我国每年因为肠炎沙门氏菌引起的食物时有发生,并且常是群发性的中毒。肠炎沙门氏菌具有垂直传播的特点,能够在输卵管和卵黄里分离到,因此食用未完全加热至熟的蛋品可以导致人类食物中毒[2]。但是我国较少发生因食用禽蛋导致的肠炎沙门氏菌食物中毒,这与我国饮食习惯有关[18]。

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