EGCG对肾小管上皮细胞转分化过程中MMP9与Cyclin D1表达的影响及意义

赵成广，邓天麟，吴玉斌*

肾小管上皮细胞转分化(EMT)是肾间质纤维化的重要环节。肾间质纤维化时，约36%的成纤维细胞来源于肾小管局部EMT［1］。转分化的细胞以失去上皮细胞的标志物CK-18和出现间充质细胞标志物α-SMA为标志。EMT过程涉及肾小管基底膜的破坏及细胞增殖［2-3］，金属蛋白酶 9(MMP9)降解肾小管基底膜的Ⅳ型胶原，有利于转分化后的肾小管上皮细胞迁移到肾间质，通过增殖，加剧肾纤维化。近年来发现，表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)具有抗肝纤维化的作用［4-6］，EGCG是否对肾脏肾小管上皮细胞转分化有抑制作用尚无报道。本实验采用EGCG干预TGF-β1诱导的大鼠肾小管上皮细胞株NRK细胞，通过检测CK-18、α-SMA及细胞中MMP9、细胞周期素(Cyclin)D1的表达改变，探讨EGCG对NRK细胞转分化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 实验细胞:大鼠肾小管上皮细胞株(NRK-52E)，购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。L-EGCG购于 Sigma公司。TGF-β1购于 Peprotech 公司。α-SMA、CK-18、MMP9、Cyclin D1兔抗大鼠IgG(一抗)购于Santa Cruz公司。PrimeScriptTMRT Reagent Kit、Real time quantitive PCR(SYBRRPremix Ex TaqTM)试剂盒购于大连宝生物工程有限公司)。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2 试验方法 肾小管上皮细胞培养与分组:NRK-52E大鼠肾小管上皮细胞株常规培养，经无血清的DMEM培养基同步化作用24 h，之后将培养的细胞随机分为4组:1组:正常对照组(N)，以DMEM培养液为空白对照。2组:TGF-β1诱导组(培养液中TGF-β1的浓度为10 ng/mL)。3组:EGCG 200 μg/L 干预组，培养液中 TGF-β1的浓度为10 ng/mL，EGCG 浓度为 200 μg/L。4组:EGCG 400 μg/L 干预组，培养液中 TGF-β1的浓度为10 ng/mL，EGCG浓度为400 μg/L。各细胞组在作用48 h后收集细胞待测。

1.3 细胞爬片免疫组化测定 取1、2、3组同时进行细胞爬片，48 h后先PBS洗涤，再4%多聚甲醛固定，置于-20℃冰箱保存待测。采用免疫组化检测α-SMA和CK-18，每组图片取8个视野，采取日本OLYMPUS摄像系统和日本MetaMorph/BX41图像数据分析系统测定平均光密度值。平均光密度值越大，代表样本中目的蛋白含量越多。

1.4 细胞Western-blot分析 提取胞浆蛋白，按照Western-blot标准过程操作，检测指标为Cyclin D1，MMP9蛋白。采用Flour Chem V 2.0凝胶成像分析软件(America)进行吸光度扫描分析，结果以同一张膜上的β-actin作为内参，以目的蛋白与内参的吸光度比值代表目的蛋白含量的多少，比值越大，说明目的蛋白越多。

1.5 实时荧光定量PCR法测Cyclin D1、MMP9mRNA的相对表达量 采用SYBR Green I荧光染料嵌合法，分别制作目的基因和管家基因(GAPDH)的标准曲线。利用标准曲线对样品中的目的基因和管家基因分别进行定量。通过管家基因的校正，检测各组目的基因的相对表达量。根据标准曲线，荧光定量PCR仪自动分析并计算结果，目的基因mRNA的相对表达量=目的基因拷贝数/GAPDH基因拷贝数，此数值越大表明样本中目的基因含量越多。

引物序列:

Cyclin D1-F 5'-AACCACAAAGACGGAGATG-3'Cyclin D1-R 5'-CGGCGGCAAGAATG-3'MMP9-F 5'-ACCCTGCGTATTTCCATT-3'MMP9-R 5'-GCACCAGCGATAACCAT-3'GAPDH-F 5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'GAPDH-R 5'-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3'

1.6 统计学分析 应用SPSS15.0统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析，进行正态分布及方差齐性检验，各组间两两比较采用q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NRK细胞CK-18、α-SMA蛋白表达的变化

正常对照组NRK细胞中CK-18高表达，α-SMA无表达;NRK细胞被TGF-β1诱导48 h后，胞浆中CK-18蛋白表达明显减少，α-SMA蛋白出现了高表达;而NRK细胞被TGF-β1和EGCG联合作用48 h后，胞浆中 CK-18蛋白表达减少不明显，α-SMA蛋白表达较 TGF-β1诱导组少。见表 1，图1～图6。

表1 EGCG干预前后CK-18及α-SMA表达(平均积分光密度值)的变化(n=8，±s)

表1 EGCG干预前后CK-18及α-SMA表达(平均积分光密度值)的变化(n=8，±s)

注:*与对照组比较，P＜0.05;#与TGF-β1组比较，P＜0.05

组别 CK-18 α-SMA对照组0.671±0.024 0 TGF-β1诱导组 0.225±0.056* 0.857±0.045 EGCG干预组(200 μg/L) 0.531±0.078# 0.342±0.028*

图1 对照组肾小管上皮细胞(NRK)CK-18表达情况(免疫组化，×400)

图2 TGF-β110 ng/mL作用NRK细胞48 h后CK-18表达明显减少(免疫组化，×400)

图3 EGCG 200 μg/L+TGF-β110 ng/mL作用NRK细胞48 h后，CK-18表达无明显减少(免疫组化，×400)

图4 对照组NRK细胞基本无α-SMA蛋白(免疫组化，×400)

图5 TGF-β110 ng/mL作用NRK细胞48 h后α-SMA蛋白出现高表达(免疫组化，×400)

图6 EGCG 200 μg/L+TGF-β110 ng/mL作用NRK细胞48 h后α-SMA蛋白表达减少(免疫组化，×400)

2.2 NRK细胞Cyclin D1、MMP9蛋白及其mRNA表达变化 NRK细胞被TGF-β1诱导48h后，Cyclin D1、MMP9蛋白及其mRNA表达明显升高;而NRK细胞经TGF-β1和EGCG联合作用后，上述各指标较TGF-β1诱导组表达减少，并且EGCG浓度为400 μg/L时，比200 μg/L能进一步减轻上述蛋白及mRNA的表达。见表2、表3，图7、图8。

表2 EGCG干预前后Cyclin D1蛋白及其mRNA表达的变化(n=8，±s)

表2 EGCG干预前后Cyclin D1蛋白及其mRNA表达的变化(n=8，±s)

注:*与对照组比较，P＜0.05;#与TGF-β1组比较，P＜0.05

组别 Cyclin D1/actin Cyclin D1 mRNA/GADPH对照组0.19±0.02 0.034±0.005 TGF-β1诱导组 0.72±0.05* 0.110±0.009*EGCG干预组(200μg/L) 0.48±0.04# 0.068±0.005#EGCG干预组(400μg/L) 0.31±0.03# 0.045±0.003#

表3 EGCG干预前后MMP9蛋白及其mRNA表达的变化(n=8，±s)

表3 EGCG干预前后MMP9蛋白及其mRNA表达的变化(n=8，±s)

注:*与对照组比较，P＜0.05;#与TGF-β1组比较，P＜0.05

组别 MMP9/actin MMP9 mRNA/GADPH对照组0.45±0.05 0.002 5±0.000 3 TGF-β1诱导组 1.11±0.04* 0.007 3±0.000 6*EGCG干预组(200μg/L) 0.94±0.03# 0.005 5±0.000 3#EGCG干预组(400μg/L) 0.78±0.02# 0.003 7±0.000 5#

3 讨论

TGF-β1是一种公认的促纤维化因子［7］，可刺激上皮细胞向间充质细胞的转化［8-9］。本实验发现，TGF-β1诱导后的NRK细胞出现了α-SMA的表达，而CK-18表达减少，说明NRK细胞出现转分化;而EGCG干预后上述变化减轻，说明EGCG能够维持NRK细胞的上皮表型，减轻转分化。

图7 NRK细胞胞浆中Cyclin D1蛋白表达情况注:TGF-β1诱导组较对照组表达增加，EGCG干预组较诱导组表达减少，并且EGCG 400 μg/L组较200 μg/L减少更明显(Western-blot)

图8 NRK细胞胞浆中MMP9蛋白表达情况注:TGF-β1诱导组较对照组表达增加，EGCG干预组较诱导组表达减少，并且EGCG 400 μg/L组较200 μg/L减少更明显(Western-blot)

上皮细胞转分化为肌纤维细胞后，具有十分活跃的增殖和分泌细胞外基质的功能，通过增殖，肌纤维细胞数量增多，加剧了肾间质纤维化的过程［3］。细胞增殖通过细胞周期来实现，而细胞周期的运行则由Cyclin的周期性波动来调控。Cyclin D1是细胞周期调控网络中的重要构成之一，其蛋白量的多少关系着细胞能否通过G1/S期的检查点。Cyclin D1表达减少可使整个细胞周期停滞于G1期，而过表达可缩短G1期［10］，高表达促进细胞通过G0/G1期，在细胞增殖中发挥重要作用。有研究发现，在肿瘤细胞中，EGCG能减少Cyclin D1的表达，诱导细胞周期的G1/S期阻滞，从而发挥抗增殖作用［11-12］。

本实验发现，TGF-β1诱导的NRK细胞Cyclin D1蛋白及其mRNA表达明显升高。Cyclin D1升高可促进转分化后的细胞增殖，增加了肌成纤维细胞的数量，从而加重纤维化。给予 EGCG和TGF-β1联合作用后，Cyclin D1蛋白及其mRNA表达明显减少，提示EGCG能抑制转分化细胞的增殖，从而减轻转分化及纤维化。PCR结果说明，EGCG能从转录水平下调Cyclin D1蛋白的表达。EGCG 浓度为400 μg/L时，比200 μg/L能进一步减轻Cyclin D1蛋白及mRNA的表达，说明EGCG能以剂量依赖方式抑制Cyclin D1蛋白及其mRNA表达。

肾小管上皮细胞发生EMT过程中的关键步骤是肾小管基底膜的破坏，为转分化的细胞迁移至肾间质提供基本条件［2］，肾小管基底膜主要成分为Ⅳ型胶原，MMP9和MMP2是其降解酶。Ⅳ型胶原维持肾小管上皮细胞的表型，而间质中的Ⅰ型胶原促进了EMT的发生［13］。可见基底膜的损伤破坏是启动EMT不可缺少的环节。在多种肾间质纤维化模型中，MMPS/TIMPS比例失衡参与了肾间质纤维化的发生发展［14-15］;而在多种肿瘤细胞中，EGCG能减少MMP9的表达，而减轻肿瘤细胞的侵袭性［16-18］。本实验发现，TGF-β1诱导 NRK 细胞后，MMP9蛋白及其mRNA发生上调，提示TGF-β1通过上调 MMP9的表达，降解基底膜，促进EMT的发生。在给予EGCG保护后，MMP9蛋白及其 mRNA发生下调，提示EGCG能通过抑制MMP9的表达而保护基底膜的完整性，起到减轻转分化和纤维化的作用。EGCG浓度为400 μg/L时比200 μg/L能进一步减轻MMP9蛋白及mRNA的表达，说明 EGCG能以剂量依赖方式［19］抑制MMP9蛋白及mRNA的表达。

EGCG抑制MMP9、Cyclin D1蛋白及mRNA表达的机制尚不明确，可能与细胞内活性氧ROS有关。近年研究表明，ROS参与了细胞膜受体介导的信号转导［20］。在哺乳动物细胞中，虽然不同的生长因子或细胞因子引发各自的信号转导及细胞反应，但其作用几乎均通过ROS这条共同通路来完成，因此，这些因子可引起细胞内ROS迅速升高;如果抑制ROS生成，则阻断了外界刺激引起的相应的信号转导，细胞增殖等功能受到抑制［21］，EGCG结构中富含酚羟基，容易被氧化成醌类而提供H+，因此，具有显著的抗氧化活性和清除自由基的能力。张海燕［22］发现，ROS介导了 TGF-β1诱导的大鼠NRK细胞转分化及细胞外基质聚集，推测EGCG可能通过抑制氧化还原信号传导，从而下调Cyclin D1及MMP9的表达，进而发挥抑制细胞增殖和保护基底膜而减轻NRK转分化的作用，这为临床防治肾脏纤维化提供理论依据。

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