银杏外种皮多糖对人宫颈癌细胞系Siha增殖及侵袭的影响

杨 滨，娄晓明，吴春丽，李婉萍

银杏(Ginkgo biloba L.)是木本孑遗植物，其叶、果和外种皮皆可入药。银杏外种皮是银杏种子的外皮层，包含有大量的银杏多糖、银杏内酯、黄酮及被称作银杏酚、酸的化合物等多种物质。有报道表明，银杏外种皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides，GBEP)对胃癌、肺癌及肝癌细胞的生长具有一定的抑制效果［1-3］，但其在宫颈癌方面的研究较少。本文研究体外银杏外种皮对人宫颈癌细胞增殖及迁移的影响，探讨其对宫颈癌的治疗作用。

1 实验材料

1.1 细胞株及培养方法 细胞株:Siha细胞株购自中科院，由本实验室传代保存。细胞培养:用含有10%小牛血清的高糖RPMI1640培养基，37℃饱和湿度、5%CO2培养箱中培养，细胞贴壁生长，每2～3天传代1次。

1.2 实验仪器及试剂 酶标仪(BIOTEKElx800);AE30/31倒置相差显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司);HF90 CO2细胞培养箱(上海力申科学仪器有限公司)。细胞培养用试剂购自Hyclone公司，RNA prep pure动物组织总RNA提取试剂盒，TIANScript cDNA第一链合成试剂盒，2×Taq Real Master Mix(SYBR Green)购自天根生物科技(北京)有限公司，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，抗体购自Abcam公司，噻唑蓝(MTT)购自Sigma公司，ELISA检测试剂盒购自RB公司，其他试剂为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 银杏外种皮粗多糖的制备 称取适量银杏外种皮，置于圆底烧瓶中，按料液比1∶10、沸水浸提1 h，在热水浴中回流浸提3次，冷却后过滤，合并上清液。上清液经减压浓缩，三氯乙酸脱蛋白，离心，调pH至中性，加入一定体积的95%乙醇，使终浓度为80%。充分搅动，静置沉淀，所得沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，真空干燥即可得粗多糖。经计算，得到外种皮原料中多糖含量为6.684 g/100 g。

2.2 MTT法检测GBEP对Siha细胞的增殖影响

将GBEP用PBS溶出，调pH至中性，过滤除菌，于4℃冰箱中保存备用，GBEP稀释为 10、20、40、80、160、320 μg/mL 浓度梯度。取对数生长期细胞，调节细胞浓度为5×104个/mL，将细胞以每孔200 μL接种于96孔培养板，培养12 h，使其充分贴壁，然后换为无血清的RPMI-1640培养，加入含GBEP的无血清RPMI-1640培养液培养，每个浓度设3个复孔。对照组为不含GBEP的RPMI-1640 培养基，5%CO2，37 ℃ 中孵育 24、48、72 h。每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续放入CO2培养箱中染色4 h，吸去上清，加入200 μL DMSO溶解细胞内形成的结晶，用酶标仪测定490 nm处吸光度(OD)值，计算GBEP对Siha细胞生长的抑制率。抑制率(%)=(空白孔OD值－实验孔OD值)/空白孔OD值×100%，同时计算IC50值，并确定合适的3个实验计量和实验时间，用于后续实验。

2.3 检测GBEP对Siha细胞的侵袭抑制作用应用铺有Matrigel的Transwell小室法测定GBEP对Siha细胞迁移情况的影响，将铺胶后的Transwell小室放入24孔板中，下室加入含10%FBS的 RPMI-1640培养液 500 μL;在上室加入含GBEP 终浓度为 0、10、20、40、80、160、320 μg/mL的100 μL细胞悬液，细胞数为1×105个/孔。常规培养24、48、72 h，取出 Transwell小室，PBS 轻轻冲洗，擦去微孔膜上层的细胞，甲醛室温下固定15 min，苏木素染液染色，倒置显微镜下(×400)对迁移至微孔膜下层的细胞计数。每个样本选取5个视野计数细胞，取其均数。迁移率(%)=实验孔细胞数/空白孔细胞数×100%。

2.4 Siha细胞中人基质金属蛋白酶2(MMP-2)基因Real Time PCR检测 经MTT实验确定的实验条件，取不同浓度(0～320 μg/mL)GBEP处理下对数生长期的Siha细胞，加入裂解液收集，提取RNA，并测得浓度，逆转录后，进行Real Time PCR检测，以GAPDH作为内参，进行相对表达量分析。MMP2基因引物为:Forward primer:TGGTTTTCCTCCATCCAGTGG，Reverseprimer:CAGGTTGTCTGAAGTCACTGC。

2.5 GBFP对Siha细胞MMP-2蛋白分泌表达的影响 经MTT实验确定的实验条件，收集不同浓度GBEP处理下的 Siha细胞培养液上清，4 000 rpm离心10 min，取上清，用MMP-2 ELISA测定试剂盒检测肿瘤细胞上清中MMP-2含量。

2.6 统计方法 实验数据应用SPSS 13.0统计软件包进行统计分析，各指标用均数±标准差表示，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 MTT法检测GBEP对Siha细胞增殖的影响

MTT检测正常Siha细胞与GBEP处理后的Siha细胞在处理后24、48、72 h后的增殖情况，并绘制生长曲线，见表1、图1。结果显示，GBEP处理后的细胞较正常培养的Siha细胞增殖速度明显减缓，经计算，得到 24 h、48 h、72 h的 IC50值分别为78.09、58.25 和48.63 μg/mL，48 h 为适合实验。

表1 不同浓度及时间GBEP对Siha细胞增殖的抑制情况

图1 GBEP对Siha细胞的增殖抑制曲线

3.2 GBEP对Siha细胞侵袭的影响 利用Transwell细胞培养小室测定GBEP处理后细胞迁移能力的变化，见图2。结果显示，GBEP处理后，Siha细胞迁移细胞数明显低于正常培养细胞(P＜0.05);随着GBEP浓度的增加，细胞迁移率逐渐降低，随着药物处理时间的增加，细胞迁移率降低。

图2 GBEP对Siha细胞迁移的影响

3.3 Real Time PCR检测Siha细胞中MMP-2基因表达情况 应用Real Time PCR方法检测未经处理Siha细胞和GBFP处理后的细胞中MMP-2基因的表达情况，结果如图3所示，随着GBFP浓度的增加，Siha细胞中MMP-2基因的表达量降低，浓度为40 μg/mL时，差异有统计学意义(P＜0.05)，80 μg/mL以上时，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。

图3 不同浓度GBEP对siha细胞中MMP-2基因表达的影响

3.4 GBEP对Siha细胞上清中MMP-2分泌表达的影响 见图4。结果显示，GBFP可明显降低Siha细胞上清中MMP-2的分泌表达，80 μg/mL以上GBFP处理组与对照组相比，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。

图4 不同浓度GBEP对siha细胞MMP-2分泌表达的影响

4 讨论

多糖作为一种重要的生物活性成分，不是一种单一的化学物质，而是聚合程度不同的多种糖物质的混合物［4］。多糖具有提高免疫、抑制肿瘤等多方面功能，在植物、动物、微生物中广泛存在，近年来多糖成为天然药物的一个研究热点。银杏外种皮多糖(Ginkgo biloba exocarp polysaccharides，GBEP)是从银杏的外种皮中提得的活性多糖物质［5］。由于银杏外种皮是银杏加工过程产生的废弃物，不仅污染环境，也造成资源浪费，而从其中提取多糖，原料成本低，变废为宝，具有广阔的应用前景。

在恶性肿瘤的发生发展过程中，增殖和迁移是其主要特性，是恶性肿瘤预后不良及导致死亡的主要原因之一，因此，通过药物抑制肿瘤细胞的迁移和增殖，是癌症治疗的手段之一［6-7］。

宫颈癌在女性恶性肿瘤中位居首位，本文用MTT法观察GBEP对宫颈癌细胞株Siha增殖的抑制作用。结果表明，GBEP对Siha细胞的增殖具有抑制作用，在10～320 μg/mL剂量下，体外作用24～72 h，GBEP对 Siha细胞体外增殖的抑制率随剂量增加和时间延长而增加，具有剂量依赖性和时间依赖性，这与GBEP对其他癌细胞的研究结果相符，在GBEP对胃癌细胞及肝癌细胞的研究中有相似性。

在对细胞迁移作用的研究中，银杏外种皮多糖对宫颈癌细胞的迁移，同样起到了抑制作用，当GBEP剂量为40 μg/mL，与对照细胞相比，差异有统计学意义(P ＜0.05)，80 μg/mL以上时，差异有显著统计学意义(P＜0.01)，表明GBFP对Siha细胞的迁移具有抑制作用。同时，应用Real Time PCR方法检测了与细胞迁移相关的MMP-2基因，基质金属蛋白酶(Matrix Metallo proteinases，MMPs)是锌肽酶，是一种能降解细胞外基质的蛋白水解酶，MMPs的表达和活化与肿瘤的生长、侵袭和转移密切相关，在恶性肿瘤中MMPs经常过度表达［8］，其对肿瘤的侵蚀、转移有非常重要的作用。因此，MMPs被认为是癌症患者的预后因子和治疗靶点。Real Time PCR检测结果表明，随着GBEP浓度的增加，Siha细胞MMP-2表达量降低，这个结果也与 ELISA检测结果相同，共同证明GBEP对宫颈癌细胞Siha细胞迁移的抑制作用。

综上所述，银杏外种皮多糖对宫颈癌细胞Siha细胞的生长增殖和迁移侵袭具有抑制作用，在分子水平初步证明其具有抑制Siha细胞迁移相关基因的表达，为GBEP应用于宫颈癌治疗的可能性提供依据。

［1］ 许爱华，陈华圣.银杏外种皮多糖对人癌细胞系的抑制作用及与阿霉素的协同效应［J］.中国新药杂志，2000，9(11):753-755.

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［4］ Itokawa H，Totsuka N，Nakahara K，et al.Antitumor principles from Ginkgo bilobaL［J］.Chem Pharm Bull，1987，35(7):3016.

［5］ Ji Su KL，You Sun C，Eun JungP，et al.Phospholipase C1 inhibitory principles from the sarcotestas of Ginkgo biloba［J］.J Nat Prod，1998，61:867.

［6］ 郑小冬，吕杰强，朱雪琼，等.抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐对宫颈癌Siha细胞增殖和凋亡的影响［J］.实用医学杂志，2009，25(22):3743-3746.

［7］ 钱德英，欧阳云雁，赵杨，等.RNAi干扰HPV16E6基因对宫颈癌 Siha细胞的影响［J］.实用医学杂志，2010，26(9):1505-1507.

［8］ 陈晓锋，顾振纶，梁忠琴，等.基质金属蛋白酶与肿瘤的侵袭和转移研究进展［J］.中国药理学通报，2001，17(3):253-257.