奥美沙坦改善内皮素诱导的大鼠高血压与氧化应激

姚 丽，徐天华，张少青，魏 敏，葛丹梅，王力宁

肾素血管紧张素系统(Renin-angiotensin system，RAS)和内皮素(Endothelin，ET)系统在高血压及心血管损伤的发生发展中发挥重要作用［1-2］。有研究显示，ET参与 AngⅡ诱导的高血压［2］，而RAS在ET诱导高血压中的作用尚不清楚。另有文献报道，ET可刺激活性氧片段(Reactive oxygen species，ROS)产生［3］。本研究观察 ET-1 诱导的高血压大鼠氧化应激状态和RAS系统，包括血浆肾素活性(Plasma renin activity，PRA)、AngⅡ和血管紧张素原(Angiotensinogen，AGT)水平，脉管系统ACE和AT1受体的表达变化;同时，观察AngⅡ受体拮抗剂(AT1receptor blockade，ARB)奥美沙坦在此模型中对血压和氧化应激的影响，旨在探讨RAS在ET诱导的高血压和氧化应激中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 5～6周雄性SD大鼠随机分为4组:①对照组(1%氯化钠慢性灌注，n=7);②ET-1慢性灌注组［2.5 pmol/(kg·min)，n=7］;③ET-1+奥美沙坦组［6 mg/(kg·d)，n=7］;④ET-1+非特异性抗高血压药肼苯哒嗪治疗组［15 mg/(kg·d)饮水中给入，n=6］。戊巴比妥(50 mg/kg，腹腔内注射)麻醉下，渗透性微泵(2ML2，Alza Co.)植入大鼠颈背部皮下与血管内插管(PE-60)相连接。奥美沙坦(CS-866，日本三共制药有限公司惠赠)随食物给入。

Tail-cuff技术测量清醒状态下大鼠第0、7、14天尾部血压。第14天时斩首处死大鼠，冷冻试管(含 EDTA 5 mmol/L、依那普利20 mol/L、1，10 邻菲咯啉1.25 mmol/L、抑胃肽A 10 mol/L)快速收集血液，用以检测AGT和AngⅡ。另用冷冻试管(含EDTA 5 mmol/L)收集血标本以检测 PRA、TBARS水平。快速剥取主动脉，去除其周围组织，取5 mm的主动脉环检测产物，其余主动脉标本液氮速冻，－80℃深冻保存。

1.2 实验方法

1.2.1 Western blotting检测血浆AGT水平和主动脉ACE与AT1受体的表达 10 μg蛋白质样品加入8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中，80 V 30 min、120 V 60 min电泳结束后，在90 V 90 min、电流＜0.33 A下，将蛋白转至硝酸纤维素膜上。5%去脂牛奶/PBS-T室温下阻滞1 h，PBS-T洗膜2×10 min，一抗(羊抗鼠 AGT抗体，澳大利亚昆士兰大学惠赠)1∶5 000，4℃过夜;PBS-T洗膜3×10 min，二抗(抗羊辣根过氧化物酶标抗体1∶30 000，Sigma Co.)室温下孵育1 h;PBS-T 洗膜3×10 min，ECL显色系统显色，曝光。NIH-IDV软件系统分析图片。主动脉ACE与AT1受体的检测方法及步骤同上。一抗分别为多克隆抗ACE抗体(1∶200，Santa Cruz Biotechnology Inc.)，多克隆抗 AT1受体抗体(1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology Inc.)。二抗分别为抗羊辣根过氧化物酶标抗体(1∶1 000，Santa Cruz Biotechnology Inc.);抗兔辣根过氧化物酶标抗体(1∶4 000，Cell Signaling Technology)。

1.2.2 光泽精化学发光体系检测主动脉超氧阴离子产物()5 mm主动脉环置入37℃碳酸氢盐缓冲液平衡30 min，37℃ Krebs-HEPES缓冲液冲洗，然后置于1 mL 37℃ Krebs-HEPES缓冲液(含光泽精20 μmol/L)，避光平衡10 min，冷光仪(BLR-301，Aloka)记录化学发光，每30秒1次，共 15min。1，2-二 羟 基 苯-3，5-二 磺 酸 钠(20 mmol/L)终止产物所致发光。记录化学发光。加入Tiron前后的差值为Tiron可终止的光泽精化学发光，结果以每毫克干重组织每分钟计数(CPM)表达。生物化学分析法检测血浆TBARS水平，以评估大鼠脂质过氧化反应。放射免疫法检测血浆PRA和AngⅡ水平。

2 结果

2.1 实验开始时，各组大鼠收缩压差异无统计学意义。与对照组比较，ET-1灌注使大鼠收缩压显著升高(P＜0.05)。奥美沙坦和肼苯哒嗪防止了ET-1诱导的高血压(见图1)。

图1 各组大鼠收缩压变化

2.2 ET-1诱导的高血压大鼠RAS状态

2.2.1 大鼠血浆AGT的表达 见图2。大鼠血浆AGT有52 kD和64 kD(轻度糖基化和高度糖基化)2种形式，以52 kD表达居多。ET-1灌注未影响大鼠血浆AGT表达。与对照组比较，奥美沙坦和肼苯哒嗪都使ET-1灌注组大鼠血浆AGT表达增加(P＜0.05)。

图2 各组大鼠血浆AGT表达水平

2.2.2 与对照组比较，ET-1灌注使大鼠血浆PRA明显升高(P＜0.05)。奥美沙坦进一步升高了ET-1灌注大鼠血浆 PRA水平(P＜0.05)，见图3A)。肼苯哒嗪未影响ET-1灌注大鼠血浆PRA水平。ET-1灌注使大鼠血浆AngⅡ水平显著升高(P＜0.05，见图3B)。奥美沙坦治疗进一步升高了ET-1灌注大鼠血浆AngⅡ水平(P＜0.05)。肼苯哒嗪未影响ET-1灌注大鼠血浆AngⅡ水平。

图3 各组大鼠血浆PRA及AngⅡ水平

2.2.3 与对照组相比，ET-1灌注大鼠主动脉ACE和AT1受体表达水平差异无统计学意义(见图4)。奥美沙坦与肼苯哒嗪干预未影响ACE和AT1受体表达。

图4 各组大鼠主动脉ACE和AT1受体表达水平

2.3 ET-1诱导的高血压大鼠氧化应激状态

2.3.1 与对照组比较，ET-1灌注使大鼠血浆TBARS水平明显升高(P＜0.05，见图5A)。奥美沙坦降低了ET-1灌注大鼠血浆TBARS水平(P＜0.05)。肼苯哒嗪未影响 ET-1灌注大鼠血浆TBARS水平。

图5 各组大鼠血浆TBARS水平及主动脉产物

3 讨论

AngⅡ可强有力地刺激ET-1产生［1-4］。研究表明，AngⅡ慢性灌注可增加大鼠肾脏的ET-1产物数量，AngⅡ还可以启动血管平滑肌细胞ppET-1基因转录。另一方面，关于ET系统对RAS活性的影响尚不清楚。本研究中，ARB奥美沙坦防止了ET-1慢性灌注引起的高血压，提示在本模型中，RAS系统被激活，并参与了ET-1诱导的高血压。ET-1慢性灌注使大鼠血浆PRA、AngⅡ水平显著增加，而血浆AGT水平、血管ACE和AT1受体表达无变化，提示血浆PRA增加是血浆AngⅡ增高的原因。ET-1慢性灌注使大鼠血浆PRA增加的机制尚不清楚。有研究显示［5-6］，ET-1急性灌注使肾小球入球小动脉收缩，肾血流量减少，肾小球滤过率下降，肾血管阻力显著增加，提示血浆PRA增加可能是由于肾血管持续收缩，肾小球滤过率下降，或随后出现的肾损害引起。其他可能机制尚需进一步探讨。

有报道，ET诱导的血管收缩至少部分是通过增加ROS产物介导的［7-8］。笔者发现，ET-1慢性灌注使大鼠血管产物和血浆TBARS水平显著增加。ET-1刺激ROS产生的机制尚不明确。有报道，ET-1增加血管内皮细胞gp91phox表达和产物［9］。同时，ET-1是蛋白激酶C的强刺激物，而蛋白激酶C参与NAD(P)H氧化酶激活和产生［10］。本研究结果显示，ARB奥美沙坦防止了ET-1诱导的高血压和ROS产生。虽然有多种机制参与ET诱导的ROS产生，但至少可以推测，AngⅡ部分参与了ET-1慢性灌注诱导的ROS产生。同时，非特异性抗高血压药物肼苯哒嗪并未改变ET-1慢性灌注大鼠血浆TBARS的水平，但显著减少了血管产物。提示2种可能性:第一，肼苯哒嗪本身具有抗氧化性;第二，ROS水平降低是肼苯哒嗪降压作用的结果。目前的研究结果尚不能证实肼苯哒嗪具有抗氧化作用。

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