HPLC法测定肾移植患者血清中内源性氢化可的松浓度

王晓杰，陈 荣（江苏常州市第一人民医院，常州市 213003）

糖皮质激素是最早使用的预防和治疗肾移植排斥反应的药物。从20世纪20－80年代，应用于肾移植的免疫抑制剂有了很大的发展，但激素作为基本药物一直是不可替代的。目前糖皮质激素的给药多依据个人经验，而忽略不同患者之间的药动学的差异。内源性糖皮质激素的变化可作为肾移植排斥反应的诊断及判断排斥反应对糖皮质激素冲击治疗是否敏感的指标[1]。为此，笔者建立了测定肾移植患者血清中内源性氢化可的松浓度的方法，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱系统，包括2996紫外检测器、1525双泵、717自动进样器、Empower色谱工作站（美国Waters公司）；BT25S电子分析天平（德国塞多利斯公司，精密度:1×10－5g）；KTC-16H高速台式离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；低温冰箱（日本Sanyo公司）；涡旋混合器（上海医科大学仪器厂）。

1.2 试药

可的松对照品（美国Sigma公司，含量:98%，批号:2007117）；氢化可的松对照品（美国Sigma公司，含量:98%，批号:035K1291）；内标:苯巴比妥对照品（中国药品生物制品检定所，批号:171222-200303）；甲醇、乙腈为色谱纯，水为双重蒸馏去离子水，其他试剂均为分析纯。小牛血清（杭州四季青生物公司，批号:050516）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:迪马Diamonsil C18（250mm×4.6mm，5 μm）；流动相:乙腈-水-甲醇（51∶136∶77）；流速 :1.2mL·min－1；检测波长:245 nm；柱温:30 ℃；进样量:30μL。该色谱条件下，血清中的杂质不影响氢化可的松的测定。氢化可的松及内标苯巴比妥的峰保留时间分别为12.2min和7.0min。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.小牛血清+内标；B.健康者血清+氢化可的松对照品+可的松对照品；C.健康者血清+内标；D.肾移植患者血清+内标；1.苯巴比妥；2.可的松；3.氢化可的松Fig 1 HPLC chromatogramsA.bovine calf serum spiked with internal standard；B.human serum spiked with cortisol and cortisol；C.human serum spiked with internal standard；D.kidney-transplant recipients serum spiked with internal standard；1.phenobarbital；2.cortisone；3.cortisol

2.2 血清样品的处理

取血清500μL，加入内标溶液（50mg·L－1苯巴比妥）10μL和乙酸乙酯3mL，涡旋混合器振荡1min后，4500 r·min－1离心15min，取上清液于尖底试管中，60℃水浴氮气吹干，残渣用甲醇50μL溶解，进样30μL。

2.3 标准曲线的制备及最低检测限

取小牛血清[2]500μL，加入内标溶液（50mg·L－1苯巴比妥）10μL，再加入125μg·mL－1氢化可的松对照品溶液，使其浓度分别为50、100、150、200、250、300μg·L－1，按照“2.2”项下方法处理，测定样品及内标的峰面积，以氢化可的松血药浓度（X）为横坐标，氢化可的松与内标的峰面积比（Y，其中氢化可的松与内标的峰面积比要减去小牛血清在氢化可的松处微小峰与内标的峰面积比）为纵坐标进行线性回归，得回归方程为:Y＝0.1455X+0.01666（r＝0.9994）。结果表明，氢化可的松血药浓度在50～300μg·L－1范围内线性关系良好，根据信噪比（S/N）≥3计算氢化可的松的最低检测限为8μg·L－1。

2.4 回收率试验

配制低、中、高3种不同浓度（75、175、275μg·L－1）的氢化可的松血清样品各3份，按照“2.2”项下方法处理，记录峰面积，同时以相同量对照品溶液直接进样的峰面积为对照，计算提取回收率。结果低、中、高3种浓度的提取回收率分别为（80.12±2.3）%、（79.77±3.5）% 、（75.48±4.5）%，3种浓度的提取回收率均＞70%。另测定样品及内标的峰面积，计算其峰面积比值，代入标准曲线求出对应浓度，计算低、中、高3种浓度的方法回收率分别为（103.12±4.53）%、（100.77±4.07）% 、（101.61±6.92）%。

2.5 精密度试验

配制低、中、高3种不同浓度氢化可的松标准血清各5份，按照“2.2”项下方法测定样品及内标的峰面积，考察其日内及日间精密度，结果见表1。

2.6 稳定性试验

配制低、中、高3种不同浓度的氢化可的松标准血清各5份，置－38℃冰箱中保存。按照“2.5”项下方法操作，在2周内完成稳定性试验。结果3种浓度RSD均＜10%，提示样品可于－38℃冰箱保存至少2周。

表1 精密度试验结果（，n＝5）Tab 1 Results of precision tests（ ，n＝5）

表1 精密度试验结果（，n＝5）Tab 1 Results of precision tests（ ，n＝5）

加入量/μg·L-1 75175275日内实测值/μg·L-1 77.34±3.39176.35±7.12279.43±19.04日内RSD/%4.394.046.81日间实测值/μg·L-1 77.13±7.06173.79±7.11280.27±14.26日间RSD/%9.164.095.09

2.7 肾移植患者血清中氢化可的松浓度测定

肾移植随访患者年龄17～62岁，平均41.6岁，术后肾功能稳定。肾移植术后均用环孢素A（CsA）+霉酚酸酯（MMF）+泼尼松三联用药，所有受检者于上午8∶00－8∶30时静脉采血2mL进行检测，结果显示各组术后3个月以上肾移植患者内源性氢化可的松浓度逐渐稳定。肾移植患者氢化可的松水平检测结果见表2。

表2 肾移植患者氢化可的松水平检测结果（）Tab 2 Concentrations of cortisol in patients underwent kidney transplantation（ ）

表2 肾移植患者氢化可的松水平检测结果（）Tab 2 Concentrations of cortisol in patients underwent kidney transplantation（ ）

内源性糖皮质激素肾移植患者氢化可的松浓度/μg·L-1 1～3个月（38例）31.89±21.423～6个月（30例）45.26±29.266～12个月（44例）49.69±22.00＞12个月（52例）53.56±29.86

3 讨论

根据受体调节的下调（Downregulation）原则，血浆皮质醇浓度降低，淋巴细胞糖皮质激素受体水平增高，而淋巴细胞糖皮质激素受体水平增高的患者对外源性激素治疗敏感[3]，提示内源性糖皮质激素的测定可能对排斥反应的诊断有帮助。器官移植中糖皮质激素在免疫及抗排斥反应中的作用机制，以及其对全身的影响还缺少深刻的认识，明显落后于其他免疫移植药物的研究。本组数据显示肾移植术后肾功能稳定患者内源性糖皮质激素水平随移植时间逐渐升高，术后3个月，患者的内源性氢化可的松浓度逐渐趋于稳定，平均为（52.15±25.58）μg·L－1，与文献结果基本一致[4]。排斥患者数据是否存在差异则有待进一步探讨。

本法的建立及肾移植术后内源性氢化可的松浓度的测定，为进一步研究及指导临床使用糖皮质激素提供了理论依据。

[1]罗志刚，唐孝达，杨宇如，等.肾移植排斥反应时血糖皮质激素监测的意义[J].中华器官移植杂志，2001，22（3）:158.

[2]秦永平，余 勤，罗志刚.高效液相色谱法同时测定血清中氢化泼尼松和氢化可的松[J].药物分析杂志，1995，15（4）:9.

[3]Morineau G，Boudi A，Barka A，et al.Radioimmunoassay of cortisone in serum，urine，and saliva to assess the status of the cortisol-cortisone shuttle[J].Clin Chem，1997，43（8 Pt 1）:1397.

[4]Oka K，Hirano T，Shimodaira H，et al.Suppression of endogenous cortisol for evaluating pharmacodynamics of prednisolone in early allograft rejection in renal transplantation[J].Clin Chem，1990，36（3）:481.