HPLC法快速测定肺癌患者血浆中依托泊苷的浓度及其治疗窗考察

刘治安，彭玉龙，许斌，莫炫永，蔡宇（.广东东莞市东华医院，东莞市 50；.广东东莞市国药质量检测中心，东莞市 500；.暨南大学，广州市 506）

临床上肺癌是最常见的恶性肿瘤，其化疗方案中常用抗肿瘤药是依托泊苷（Etoposide，VP-16）[1]。VP-16是天然产物鬼臼脂的半合成衍生物，在体内代谢由细胞色素P450（CYP）3A酶催化，VP-16的疗效和毒性与血药浓度、体内药物代谢酶的活性有较强的相关性[2]。为使VP-16能安全、有效地用于肺癌患者，笔者采用高效液相色谱（HPLC）法测定其在肺癌患者中的血药浓度，并结合临床疗效和不良反应的观察结果，建立肺癌患者VP-16最佳血药浓度范围。

1 材料

1.1 仪器

1200RRLC高分离度快速液相色谱仪，包括G1314B VWD SL紫外检测器、G1312B Bin Pump SL二元泵、G1316B TCC SL柱温箱、G1329B ALS SL标准自动进样器（美国Agilent公司）；TDL-5-A低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ5200超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药

VP-16对照品（中国药品生物制品检定所，批号:100388-200401）；甲醇为色谱纯，水为蒸馏水（经0.2 μm微孔滤膜过滤）；空白人血浆为广东东莞市东华医院检验科提供的健康体检者血浆。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Waters Symmetry®C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流动相:甲醇-水（45∶55，流动相在使用前需经0.2 μm微孔滤膜过滤）；流速:1mL·min－1；检测波长:220 nm；进样量:20μL；柱温:30℃。

2.2 血浆样品的处理

患者用药后45min时采血5～6mL，常温静置2 h，取血浆3mL离心（4000 r·min－1）10min，精密量取血清1.00mL，再精密加入甲醇至2.00mL，涡旋混匀1min，静置10min，再离心（4000 r·min－1）10min，取上清液用0.2 µm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。进样20μL测定，记录色谱图（分析时间为12min），VP-16的保留时间约为7.52min。高效液相色谱图见图1。

2.3 检出限及定量限的测试

开启HPLC仪，运行约3 h至仪器基线平直后，量取基线噪声（N），按3倍N的电平值（mV）确定最小检出峰面积。再配制含依托泊苷为5.0、10.0μg·mL－1的模拟血浆样品数份，按“2.1”项色谱条件进行操作，据其图谱的依托泊苷峰面积，按最小检出峰面积计算本方法的最小检出浓度，即检出限，结果检出限为1.295μg·mL－1；再以检出限的2～3倍估算本方法的定量限，为2.59μg·mL－1。

图1 高效液相色谱图A.空白血清；B.依托泊苷对照品溶液；C.受试者血样；1.VP-16Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank serum；B.etoposide control；C.blood sample of object；1.VP-16

2.4 标准曲线的制备

准确称取依托泊苷对照品2.59mg，置于25mL容量瓶中，加甲醇使之溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得标准贮备液。精密量取VP-16标准贮备液0.05、0.10、0.20、0.50、1.00mL，再精密加入健康人空白血清至2.00mL，混匀，精密量取1.00mL，按“2.1”项色谱条件进行操作，记录色谱。根据VP-16色谱峰的峰面积用外标法定量，以VP-16浓度（c）对峰面积（A）进行线性回归，得回归方程为A＝51089985.3934c+278656.3980（r＝0.9997）。结果表明，依托泊苷血药浓度在2.59～51.8μg·mL－1范围内线性关系良好。

2.5 进样重复性试验

取空白人血浆1.0mL，加入依托泊苷标准贮备液，使之成浓度为10.4μg·mL－1的依托泊苷血浆溶液。按“2.1”项色谱条件进行操作，进样6次记录峰面积，计算峰面积的RSD为0.2%（n＝6）。

2.6 方法回收率及精密度试验

用标准贮备液配制成VP-16低、中、高3种不同浓度血清（每浓度5管），按“2.2”项下方法操作，计算出平均回收率。另取上述低、中、高浓度血清样品，每浓度日内测定5次，计算日内RSD；同法每浓度连续5 d，每日测定5次，计算日间RSD，记录结果，回收率及精密度试验结果见表1。

表1 回收率及精密度试验结果（n＝5）Tab 1 Results of precision and recovery tests（n＝5）

2.7 贮备液的稳定性考察

取VP-16对照品的贮备液，分别在第1、7、14、30、60、90天用流动相配制成浓度为50.0、25.0、10.0μg·mL－1的溶液，直接进样20μL，记录峰面积，计算得RSD平均值为1.8%。

2.8 对照品加血浆的稳定性考察

制备高、低2种浓度（10.0、5.0μg·mL－1）VP-16对照品血浆各5份，按“2.2”项方法操作，分别在第0、4、8、12、16 h时进样20μL，记录对照品及内标的峰面积。计算高、低2种浓度的VP-16对照品峰面积的RSD平均值为0.7%。

2.9 药物之间的干扰性试验

笔者选择了临床常与VP-16合用的药物进行考察，选定使用较多的药物有苯巴比妥、维拉帕米及多种抗癌药如氟尿嘧啶、阿霉素、顺铂、环磷酰胺、阿糖胞苷和羟基脲，结果受试者血清样品图谱显示，其他药品保留时间均＜6min，无干扰VP-16的色谱峰，表明本法测定VP-16的专一性强。

2.10 结果分析

在本院化疗的40例肺癌患者中，剔除使用VP-16前经临床检查有心、肺、肝、肾功能不全及化疗疗程不足者4例，选择余下36例分为3组，连续5次，每日1次（或隔日1次）根据常规分别给予依托泊苷50、75、100mg·m－23种剂量组静脉滴注后，在第45min时采血，置于无抗凝剂试管中，常温静置2 h，按“2.2”项下方法操作后取血清1.00mL测定VP-16浓度，同时判定临床疗效和观察不良反应，结果见表2。

表2 依托泊苷临床疗效、不良反应与血药浓度关系Tab 2 Correlation of clinical efficacy of etoposide with adverse drug reaction and plasma concentration

3组血药浓度两两比较结果显示，3组间差异均有统计学意义（P＜0.05）；剂量75mg·m－2组与100mg·m－2组疗效差异无统计学意义（P＝0.48），剂量50mg·m－2组与75mg·m－2组疗效差异有统计学意义（P＜0.01）；剂量50mg·m－2组与100mg·m－2组不良反应差异有统计学意义（P＜0.01），剂量50mg·m－2组与75mg·m－2组、剂量75mg·m－2组与100mg·m－2组不良反应差异均无统计学意义（P＝0.10、0.08）。综上，剂量75mg·m－2组的血药浓度为最佳血药浓度范围。

3 讨论

本研究是用一种快速、灵敏、准确、样品处理简单的方法对VP-16进行体内血药浓度测定，旨在研究肺癌患者联合使用多种药物后，快速检测血浆中VP-16的药物浓度。

有关VP-16血药浓度测定方法，文献报道有内标法[3]和外标法，血浆样本的处理方法多以氯仿或乙酸乙酯提取VP-16[2，4]，挥干提取液后以流动相溶解残留液进样。本法则以甲醇对样品进行混匀，沉淀蛋白，再以0.2µm微孔滤膜过滤后，取滤液进样，方法简单，回收率高，故省略了提取回收率试验。其准确度和定量限符合患者实际治疗后VP-16的测定要求，适合于VP-16体内浓度的快速分析。对其中6名肺癌患者在使用剂量为100mg·m－2时，测定VP-16的浓度范围在5～15μg·mL－1之间，同文献报道的结果相似[5]。

VP-16的临床疗效按世界卫生组织（WHO）制定的指标为评价标准。疗效分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）及进展（PD），有效为CR+PR，无效为SD+PD；不良反应分为1～4度。其不良反应有骨髓抑制如白细胞减少、血小板减少、贫血，消化道反应如恶心、呕吐、食欲不振、口腔炎、腹泻、腹痛、便秘等，皮肤及其附件反应如皮疹、红斑、瘙痒，其他如脱发、手足麻木、头痛、发热、心电图异常、低血压、静脉炎等症状。本文选择对机体影响大的骨髓抑制作为观察对象。

本文得出的结论是肺癌患者VP-16血药浓度治疗窗应为6.525～9.115μg·mL－1，在此浓度范围时，该药物使用安全、有效。

[1]吴一龙主编.肺癌多学科综合治疗的理论实践[M].第1版.北京:人民卫生出版社，2001:128、230.

[2]陆晓彤，唐跃年，张 健，等.高效液相色谱法测定儿童白血病患者中依托泊苷血药浓度[J].中国药房，2006，17（14）:1075.

[3]葛勇前，陆国椿.高效液相色谱法测定人血浆依托泊苷浓度[J].中国临床药学杂志，2001，10（5）:305.

[4]赵国琴，许健健，张海燕，等.HPLC法测定皮下植入依托泊苷的血浆浓度[J].中国新药杂志，2003，12（3）:197.

[5]陆基宗，许英华，贺 晴，等.高效液相色谱法测定白血病人依托泊苷血药浓度及其药物动力学研究[J].中国现代应用药学杂志，2001，18（1）:37.