EMIT法与HPLC法测定人血浆中环孢素A浓度的比较研究

宋晓勇，张永州，吴先闯，王云香，吕维玲，杨磊（.河南大学淮河医院，开封市 475000；2.河南大学药学院，开封市 475000）

环孢素A（CsA）是临床上常用的免疫抑制剂，主要用于预防器官或组织移植所发生的排斥反应及重型再生障碍性贫血。因其有效血药浓度范围窄、患者个体差异大[1]，因此对临床应用的CsA进行血药浓度监测可有效地提高疗效并减少毒副反应的发生[2]。目前，临床上测定CsA血药浓度的方法有免疫法和高效液相色谱（HPLC）法。酶放大免疫法（EMIT）是一种均相酶免疫分析技术，检测原理是样本中的药物与用酶标记的药物竞争抗体结合位点，与抗体结合后，酶的活性降低，可以根据酶的活性来确定样本中待测物的浓度。该法样品前处理简便，自动化程度高，测定周期短，样本量大。本试验收集本院服用CsA的肾移植患者稳态谷浓度血样20份，分别用HPLC法和EMIT法进行测定，考察2种不同测定方法的区别和相关性。

1 材料

1.1 仪器

LC-10A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；美国Vival_E临床化学分析系统（荷兰Vital Scientific N.V.公司制造，美国Dade Behring公司销售）；XH-2000-I型涡旋混合器（天津医疗器械厂）；LD5-2A型高速离心机（北京医用离心机厂）；电热水浴箱（北京医疗设备厂）。

1.2 试药

CsA对照品（中国药品生物制品检定所，批号:130495-200202，纯度:99.5%）；内标:环孢素D（CsD）对照品（福建生物药品检验所，批号:0104006-416，纯度:99.0%）；EMIT法测定试剂:Emit 2000 CsA前处理液（批号:6R719UL-C1）、Emit 2000 CsA定标液（批号:6R119UL-C2）、Emit 2000 CsA检测试剂（批号:6R079UL-C2）、Emit 2000CsA质控（批号:7190）均购自美国Dade Behring公司（丽珠试剂公司销售）；乙腈、甲醇为色谱纯，乙醚、正庚烷、正己烷为分析纯；纯净水由本医院血液透析科制备。

2 方法

2.1 样本收集

收集我院2010年8月－2011年2月服用CsA的肾移植患者血样20份。将分离的血浆分成2份，一份样本用HPLC法测定，另一份样本用EMIT法测定。

2.2 HPLC法[3]

2.2.1 色谱条件:色谱柱为Kromasil C18（250mm×4.6mm，5 μm），流动相为乙腈-甲醇-水（1600∶300∶150），紫外检测波长为210 nm，柱温70 ℃，流速为0.8mL·min－1，进样量为25μL。

2.2.2 原理:用系列浓度CsA和内标CsD的峰高比及对应的CsA浓度作标准曲线，把所测样品与内标的峰高比代入该曲线即得CsA浓度。

2.2.3 血样处理:空白血样0.4mL+标准液（血样0.5mL加（CsD）100μL，涡旋混匀）0.1mL+250mmol·L－1氢氧化钠（NaOH）150μL，涡旋混匀后置于45～50 ℃水浴孵育5min（破坏红细胞），再混匀，加乙醚3mL，涡旋提取8min，3000 r·min－1离心5min。分离有机层转入尖底试管，于45～50℃水浴通气吹干，加入甲醇-水（7∶3）300μL溶解，用正庚烷-正己烷（1∶1）1.5mL反复萃取2次，1500 r·min－1离心5min，然后吸弃上层液，下层液于45～50℃水浴通气吹干，残渣用甲醇-水（7∶3）50μL充分溶解，进样25μL进行检测。

2.2.4 色谱图:取空白血样、空白血样+CsA对照品+内标处理后进样25μL测定，记录色谱。色谱详见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血样；B.空白血样+CsA对照品+内标；1.CsA；2.CsDFig 1 HPLC chromatogramsA.blank blood sample；B.blank blood sample+CsA+internal standard；1.CsA；2.CsD

由图1可知，CsA和CsD（内标）色谱保留时间分别为5.68、6.47min，且色谱峰与全血中的内源性杂峰分离良好，易准确定量。

2.2.5 方法学验证:将CsA和CsD的峰高比（Y）对应的CsA浓度（X）作线性回归，得回归方程为Y＝0.0013X－0.0083（r＝0.9997）。结果表明，CsA血药浓度在50～1600 ng·mL－1范围内线性关系良好。另用不同浓度的CsA加空白血样配制成100、400、800 ng·mL－1系列浓度的血样，按“2.2.3”项下方法处理，进行日内、日间精密度和回收率测定。结果，日内RSD（n＝5）分别为4.1%、3.0%、1.2%，日间 RSD（n＝5）分别为4.0%、3.1%、2.0%，回收率分别为98.2%、99.5%、100.4%。

2.3 EMIT法

2.3.1 样本测定:按照美国Dade Behring公司Vival_E临床化学分析系统的标准操作规范及试剂使用说明，用Emit 2000 CsA相应试剂盒处理样本并进行检测。每批次测定样本时需对质控品进行平行测定。

2.3.2 精密度及准确度:分别取低、中、高浓度的CsA质控品，分别于同日和不同日测定日内、日间RSD并考察其准确度。结果，日内、日间RSD均在5%以内，回收率也在90%～110%之间，见表1。

表1 EMIT法测得的CsA精密度和准确度试验结果（，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision test of CsA concentration determined by EMIT（ ，n＝5）

表1 EMIT法测得的CsA精密度和准确度试验结果（，n＝5）Tab 1 Results of recovery and precision test of CsA concentration determined by EMIT（ ，n＝5）

浓度/ng·mL-1 75350650回收率/%99.89±2.81100.41±1.84100.47±1.35日内精密度测得量/ng·mL-1 74.92±2.11351.42±6.43653.06±8.76 RSD/%2.821.831.34日间精密度测得量/ng·mL-1 74.26±2.72348.10±9.08645.62±12.21 RSD/%3.662.611.89

2.4 数据分析

分别用EMIT法和HPLC法测定血浆中CsA浓度。样本的正态性检验采用Kolmogorov-Smirnov法。如符合正态分布，则用配对t检验比较2组样本均数有无差异，Deming回归法比较2种测定方法的相关性；反之则用Wilcoxon配对检验和Passing-Bablok回归法进行分析[4]。同时绘制EMIT法和HPLC法测定的散点图和Bland-Altman偏差图。数据分析采用MedCalc软件（Version 11.5.1，www.medcalc.be）。

3 结果

Kolmogorov-Smirnov正态分布检验结果表明，2种方法测定血浆中CsA浓度结果均呈正态分布。配对t检验显示2种方法测得的CsA血药浓度有显著性差异（P＜0.05）。散点图和Bland-Altman偏差图见图2（横坐标为EMIT法和HPLC法测定同一样本浓度均值（ng·mL－1）；纵坐标为EMIT法和HPLC法测定同一样本浓度之差（ng·mL－1）；Mean为EMIT法和HPLC法测定同一样本浓度之差的均值）。EMIT法和HPLC法测得的血浆CsA浓度的回归和相关性分析结果见表2。

图2 EMIT法和HPLC法测得的人血浆CsA浓度的散点图和Bland-Altman偏差图A.散点图；B.Bland-Altman偏差图Fig 2 Scatterplots and Bland-Altman of CsA concentration determined by EMIT vs.HPLCA.scatterplots；B.Bland-Altman

表2 EMIT法和HPLC法测得人血浆CsA浓度的回归和相关性分析结果Tab 2 Regression and correlation analysis of CsA concentration determined by EMIT vs.HPLC

由表2可知，EMIT法和HPLC法测定血浆中CsA浓度的相关方程为:Y＝－10.468+1.216X（r＝0.9940）。Bland-Altman偏差图说明EMIT法测定血浆中CsA浓度较HPLC法高26.4 ng·mL－1，95% 可信区间为（－2.8～55.6）ng·mL－1。

4 讨论

比较2种分析方法时，研究方法主要有回归法和图解法。本研究采用Passing-Bablok回归和Bland-Altman偏差图法比较EMIT法和HPLC法结果，虽然EMIT法在测定CsA的血药浓度时与HPLC法结果差异有统计学意义，EMIT法测定结果高于HPLC法，但是把2种方法测定的结果进行回归分析，获得2组测定值之间的换算公式:cHPLC＝－10.468+1.216cEMIT（r＝0.9940），具有较好的相关性。此换算公式仅限于了解在已知浓度点上2种方法结果间的差异，以帮助临床上判断结果间的关系，而不能将HPLC法测定值换算成EMIT法测定值在EMIT的参考范围内进行临床应用；相反，应将其结果放入特有的参考值进行临床评价。

EMIT法是利用抗原抗体相互识别并结合来产生检测信号，当某些抗原具有与待测药物相同的抗原表面标志或者抗体有着多个抗原结合位点时，可导致抗体与那些化学结构相近于母体的代谢产物、样本中的内源性物质产生交叉反应，所以这也可能是其测得结果高于HPLC法所得结果的原因。

[1]陈江华.免疫抑制剂在肾移植中的应用进展[J].实用医院临床杂志，2008，5（4）:11.

[2]孙增先，邢晓东.环孢素A治疗药物监测研究进展[J].中国药房，2010，21（10）:932.

[3]宋晓勇，张永州，王云香.HPLC法与荧光偏振免疫法检测血样中环孢素A浓度的比较研究[J].中国药房，2007，18（23）:1788.

[4]焦 正，张 明，仲龙瑾，等.两种单克隆抗体荧光免疫偏振法测定人全血中环孢素浓度的比较[J].中国医院药学杂志，2006，26（7）:790.