苯巴比妥在中毒大鼠体内死后分布研究

王晋涛，郭建军，尉志文，万东方，王勇，王玉瑾，贠克明

苯巴比妥（phenobarbital）又称鲁米那（luminal），属于长效巴比妥类镇静催眠药，具有抗焦虑、镇静、催眠、抗惊厥、抗癫痫及中枢性肌肉松弛作用［1］，已经在临床应用多年。由于服用苯巴比妥中毒及大剂量苯巴比妥进行自杀报道的案例较多［2］，成为法医工作者非常重视的临床中毒药物之一。目前，有关苯巴比妥的研究虽然有很多报道［3－6］，但主要集中于药效学及药动力学、作用机制及机体内苯巴比妥含量的测定［5－9］，有关苯巴比妥死后分布研究较少。因此，本实验建立苯巴比妥死后分布动物模型，研究苯巴比妥在大鼠体内的死后分布规律，为苯巴比妥中毒死亡案件的检材采取和结果分析提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 TRACE GC＆DSQ 气相色谱／质谱联用仪，美国Thermo Finnigan公司；TRACE 2000GC 气相色谱仪，美国Thermo Finnigan公司。

1.2 气相色谱－质谱联用仪条件 DB－5MS毛细管柱（30m×0.25m×0.25μm），EI源70ev；质量范围50～650，柱温130 ℃（1min）→10 ℃（1min）→240 ℃（2 min）；离子源温度200 ℃，传输线温度250 ℃，载气：He，1.5mL／min。

1.3 气相色谱条件 DB－5 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25μm），柱温130 ℃（1min）→10 ℃（1min）→240 ℃（2 min）；检测器：300 ℃，空气60kPa，氢气2.3kPa，载气：N2，1.5mL／min，NPD 检测器。

1.4 试剂 苯巴比妥对照品购于公安部物证鉴定中心，苯巴比妥片（上海金山制药有限公司，批准文号：国药准字H31021610）；10%盐酸溶液；丙烯巴比妥（内标液）配制成1.0mg／mL醇储备液，置冰箱保存；其他试剂均为分析纯。

1.5 动物模型 雄性Wistar大鼠12只，体重200g±20g，随机分为LD50组和2LD50组，每组6只，实验前隔夜禁食。经胃匀速注入LD50（0.66mg／kg）和2LD50（1.32mg／kg）苯巴比妥。待呼吸和心跳全部消失时，迅速解剖动物，取心血、心、肝、脾、肺、肾、脑、胃等冷冻保存待检。

1.6 样品提取和检测 取固体检材1g或血1mL，加蒸馏水1mL，加入内标液20μL，振荡，固性检材超声细胞粉碎（JYD－650L智能型）匀浆3min，10%HCl调pH2～3，振荡摇匀，加入5mL乙醚，振荡15min，1 800r／min离心10min，将上清液移入另一干净且干燥试管中，重复萃取一次。40 ℃恒温水浴中挥干，残渣用20μL无水乙醇定容，取1μL 进样检测，利用保留时间结合特征离子峰（气－质联用）定性，内标法和工作曲线法（气相色谱）定量［7，8］。

1.7 工作曲线和回收率

1.7.1 工作曲线 取空白大鼠肝脏1g和血液1mL分别加入苯巴比妥标准溶液及丙烯巴比妥溶液，配制成含有苯巴比妥0.5μg／g（μg／mL）、1μg／g、2μg／g、4 μg／g、8μg／g、10μg／g、12μg／g、16μg／g、18μg／g、20 μg／g、24μg／g、32μg／g和丙烯巴比妥20μg／g的系列样品，按1.6项方法提取并检测。以苯巴比妥浓度为横坐标（X），苯巴比妥与内标丙烯巴比妥的峰面积之比为纵坐标（Y）进行线性回归，所得肝脏线性回归方程Y＝0.021 2X－0.000 4，r2＝0.994；血液线性回归方程Y＝43.476X＋0.817，r2＝0.995 5。结果表明，肝脏和血液中苯巴比妥在0.1μg／g～32μg／g线性关系良好。

1.7.2 回收率 空白肝中加入苯巴比妥标准溶液0.5μg、16μg、32μg，按1.6方法提取并检测，工作曲线法计算检材中苯巴比妥含量，肝中苯巴比妥的提取回收率为（95.8±2.4）%～（118.3±6.2）%。

1.8 统计学处理 各组数据用SPSS 11.5软件对组织中苯巴比妥的含量进行方差分析及t 检验，数据以均数±标准差）表示。

2 结 果

2.1 中毒症状 大鼠在苯巴比妥灌胃后活动明显减少，出现嗜睡症状，LD50组灌胃7.24h±3.17h后死亡，2LD50组灌胃1.33h±0.25h后死亡。

图1 染毒大鼠肝脏中苯巴比妥气相色谱图

2.2 GC和GC／MS检测 苯巴比妥和丙烯巴比妥保留时间分别为10.45min和6.66min，峰形对称，可完全分离，溶剂和空白脏器提取内源性杂质对苯巴比妥和丙烯巴比妥无干扰。详见图1～图6。

图2 染毒大鼠肝脏中苯巴比妥总离子流色谱图

图3 染毒大鼠肝脏中苯巴比妥质谱图

图4 染毒大鼠肝脏添加内标物丙烯巴比妥质谱图

图5 苯巴比妥的标准质谱图

图6 丙烯巴比妥标准质谱图

2.3 两组大鼠体内苯巴比妥的含量（见表1）

表1 苯巴比妥在大鼠体内的死后分布 μg／g

表1 苯巴比妥在大鼠体内的死后分布 μg／g

组别 n心血 心 肝 脾 肺 肾 脑 胃LD50组 6 269.52±44.62 305.88±70.87 282.76±79.44 272.56±31.53 277.58±67.47 156.61±43.72 271.56±71.43 1 261.34±591.83 2LD50组 6 309.93±135.6 310.95±130.73 357.83±138.67 299.77±104.58 308.28±134.48 233.24±91.92 323.19±159.92 1 649.21±1 212.82

3 讨 论

本研究建立了苯巴比妥染毒大鼠的死后分布模型。不同剂量（LD50、2LD50）苯巴比妥灌胃后在7.24 h±3.17h 和1.33h±0.25h内死亡，考虑剂量的影响，从而研究死亡当时各脏器中药物的分布状态与剂量的关系。此模型简便易复制，可应用于苯巴比妥的法医毒物动力学研究［10，11］。

本实验结果显示，各脏器组织苯巴比妥含量由高到低分别为，LD50组：胃＞心、脑、肝、肺、脾、心血＞肾（P ＜0.05）；2LD50组：胃＞肝、脑、心、心血、肺、脾＞肾（P ＜0.05）。说明苯巴比妥死后分布不均匀，主要分布于含血丰富和脂质含量高的器官和组织中如肝、肺、心、脑。因此，药物的死后分布特征可能与组织的血流量、脂质含量和药物的酸碱性、脂溶性高低有关［12－14］。其次，胃内药物浓度最高，说明口服途径给药，存在未被吸收的药物；肾脏药物浓度最低，说明死亡当时药物在体内处于吸收分布时相，而未达到排泄时相。最后，实验结果说明剂量对死后分布趋势无影响。本实验在死后分布模型的制备中未对染毒大鼠死亡时间进行控制。因此，需进一步研究死亡时间是否对死后分布结果存在影响。

对怀疑苯巴比妥中毒（死）案件进行法医学鉴定：①心血、心、肝、肺、脑是较好的检材，其浓度能反映中毒当时的真实浓度，但要注意准确全面的取材及死后再分布的影响。②由于胃内有未被吸收的药物，不适合用于推断中毒死亡当时的浓度，但可以推断给药途径。③通过对死亡当时各脏器的分布状态，结合动态分布，推断死亡时所处时相，进而推断死亡时间。在法医案件中判断死亡当时浓度、给药途径和死亡时间，需要考虑到各种影响因素，全面、合理的分析，得出正确的鉴定结果，为案件的侦破提供一定的依据。

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