HPLC法测定人血清中丙戊酸钠的浓度

周莉华，涂琼，梅步云（.江西省人民医院，南昌市 330006；2.江西省儿童医院，南昌市 330006）

丙戊酸钠（VPA）是治疗癫痫的常用药，其有效血药浓度为50～100μg·mL－1。当其血药浓度＞100μg·mL－1时毒副作用增加而疗效无明显增加，常见不良反应有恶心、呕吐、肥胖、脱发、血小板减少和肝功能损害。其体内过程和疗效个体差异较大，导致剂量与血药浓度之间相关性较差[1]，为最大限度地发挥疗效和避免不良反应，对其血药浓度实施监测已为临床重视。本试验建立了以2-溴-对硝基苯乙酮为柱前衍生试剂，环己烷羧酸为内标，测定人血清中丙戊酸钠浓度的高效液相色谱法，方法快速、简便、准确，适用于丙戊酸钠的血药浓度监测。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪，包括SPD-10A紫外检测器、CLASS-VP色谱工作站（日本岛津公司）；80-2离心机（上海手术器械厂）；SB2200超声清洗器（美国Branson公司）；FZQ-2型涡旋振荡器（江苏泰县医疗器械厂）。

1.2 试药

丙戊酸钠对照品（湖南湘中制药有限公司，纯度＞99.5%，批号:050821）；内标:环己烷羧酸（美国Sigma公司，批号:S15382-105）；柱前衍生化试剂:2-溴-对硝基苯乙酮（美国Sigma公司，批号:S18662-045）；甲醇、三乙胺、乙腈、正己烷均为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Shimpack C18（150mm×4.6mm，5 μm）；流动相为甲醇-水（80∶20），流速:0.9mL·min－1；检测波长:265 nm；柱温:30 ℃；进样量:20μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 丙戊酸钠对照品溶液:准确称取丙戊酸钠对照品25.3mg，置于5mL容量瓶中，加纯化水溶解至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 内标溶液:准确称取环己烷羧酸20mg，至于50mL容量瓶中，用0.5 mol·L－1氨水溶液溶解至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 柱前衍生化试剂溶液:准确称取2-溴-对硝基苯乙酮5mg至10mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解至刻度。

2.3 血样处理

取血清0.1mL，加纯化水0.1mL、内标溶液50μL，以3 mol·L－1硫酸0.1mL混匀，加正己烷2mL，涡旋振荡5min，于4000 r·min－1离心5min，精密吸取上清液1mL，加2-溴-对硝基苯乙酮50μL、三乙胺10μL，于50 ℃水浴中衍生10min，用氮气吹干，用0.1mL流动相溶解，取20μL进样。

2.4 系统适用性试验

取空白血清加内标溶液，按“2.3”项下方法操作，进样20μL，得色谱图1A；将一定浓度的丙戊酸钠对照品溶液和内标溶液加入空白血清中，同法操作，得色谱图1B；取患儿口服给药后的血清样品，同法操作，得色谱图1C。结果表明，血清中丙戊酸钠和内标环己烷羧酸分离完全，无杂质峰干扰，本方法具有较高的特异性，准确度、重现性好，灵敏度较高。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白血清+内标溶液；B.空白血清+丙戊酸钠对照品溶液+内标；C.血清样品；1.环己烷羧酸；2.丙戊酸钠Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank serum+internal standard；B.blank serum+sodium valproate control+internal standard；C.serum sample；1.cyclohexanecarboxylic acid；2.sodium valproate

2.5 标准曲线的制备

精密吸取健康人的空白血清0.1mL 6份，分别加入纯化水0.1mL、内标溶液50μL，再分别精密吸取丙戊酸钠对照品溶液适量，使之成为含丙戊酸钠浓度为10、20、50、75、100、150mg·L－1的系列标准样品，混匀，按“2.3”项下方法处理后进样测定分析，记录色谱。以丙戊酸钠的质量浓度（Y）为纵坐标，丙戊酸钠与内标的峰面积比（X）为横坐标绘制标准曲线，得标准曲线方程Y＝106.8833X－3.153（r＝0.9997，n＝6），结果表明，丙戊酸钠血药浓度在10～150mg·L－1范围内线性关系良好。以信噪比（S/N）＝3计，丙戊酸钠最低检测限为1mg·L－1。

2.6 精密度试验

取低、中、高（10、50、100mg·L－1）3种浓度血样，分别依法测定5份，每日测定3次，连续测定3 d，得日内RSD分别为3.50%、4.35%、4.60%，日间RSD分别为33.23%、2.56%、2.61%。

2.7 回收率试验

2.7.1 萃取回收率:分别配制浓度为10、50、75、100mg·L－1的血浆样品，不加内标，按“2.3”项下方法处理，待挥干溶剂后，以流动相0.1mL溶解，进样分析，得药物峰面积A0；另用甲醇配制成相应浓度的对照品溶液，加3 mol·L－1硫酸0.1mL混匀，加2-溴-对硝基苯乙酮50μL、三乙胺10μL，于50 ℃水浴中衍生10min，用氮气吹干，用0.1mL流动相溶解，取20μL进样得药物峰面积A1，按回收率（%）＝A0/A1×100%计算，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（n＝3）

2.7.2 方法回收率:以空白血清配制含丙戊酸钠分别为10、50 、75、100mg·L－14种质量浓度的样品，按“2.3”项下方法处理并测定，计算方法回收率，结果见表1。

2.8 干扰试验

考虑到临床检测及药动学研究的干扰情况，在“2.1”项色谱条件下，对通常配伍的药物如苯巴比妥、卡马西平、拉莫三嗪等进行分析，结果苯巴比妥、卡马西平、拉莫三嗪等在上述色谱条件下均不出峰，以上药物对本法测定无干扰。另对江西省人民医院神经内科患者120份血样测定，也未见合用药物的干扰。120例患者血药浓度监测结果见表2。

表2 120例患者血药浓度监测结果Tab 2 Results of serum concentration in 120 cases

3 讨论

以甲醇-水（75∶25）为流动相，三乙胺用乙腈稀释成含三乙胺为0.2%作催化剂，结果显示溶剂峰太高，样品峰太小[2]；而以甲醇-水（80∶20）为流动相，三乙胺为催化剂，环己烷羧酸和丙戊酸钠峰形较好，分离完全。有文献报道流动相为甲醇-水（72∶23），波长为262 nm，柱温为25 ℃，流速为1.0mL·min－1，结果内标和丙戊酸钠保留时间分别为30min和45min[3]；而本试验条件下保留时间缩短，内标和丙戊酸钠保留时间分别约为5.5min和8.8min。另考察衍生化时衍生试剂的选择、温度、时间[4，5]，结果以2-溴-对硝基苯乙酮为衍生化试剂，温度控制在50℃，时间为10min，衍生较完全。

丙戊酸钠不溶于低极性的有机溶剂，需经酸化转化为丙戊酸后，才能用有机溶剂提取，本试验考察了使用1 mol·L－1和3 mol·L－1硫酸酸化，结果表明3 mol·L－1硫酸酸化较为完全，萃取回收率高。吸取上清液时应注意不可将水带入，否则会使衍生化不完全，水分难吹干而影响测定结果。在水浴中衍生化时，应在带塞容器中进行，以免长时间加热使游离的丙戊酸挥发，影响测定。本法采用条件简便，精密度和准确性均符合测定要求，可适用于该药临床血药浓度监测。

[1]李金恒主编.临床治疗药物监测的方法和应用[M].第1版.北京:人民卫生出版社，2003:40.

[2]祝文兵，阳利龙，李望云，等.我院儿科抗癫痫药物血药浓度监测结果分析[J].儿科药学杂志，2004，10（5）:25.

[3]孙增先，张骞峰，周金玉，等.柱前衍生-高效液相色谱法测定丙戊酸钠血药浓度[J].中国临床药学杂志，2004，13（2）:93.

[4]张志国，雷力力，李 冬，等.HPLC法测定丙戊酸钠血药浓度的衍生化影响因素考察[J].中国药房，2010，21（34）:3204.

[5]李顺炜，毛名杨，李国忠.改进的柱前衍生-高效液相色谱法测定人血清中丙戊酸钠浓度[J].中国医院药学杂志，2005，25（8）:713.