东北地区华支睾吸虫ITS1基因序列分析

唐 颖，路义鑫，韩彩霞，李晓云，宋铭忻

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

华支睾吸虫(Clonorchis sinensis)属于后睾科(Opisthorchiidae)支睾属(Clonorchis)。华支睾吸虫病是由于其成虫寄生于人、猫、犬等动物的肝脏、胆囊和胆管内而引起的一种人兽共患寄生虫病。该病主要分布于东亚和东南亚地区[1-2]，我国的广东、广西、黑龙江和吉林等省区也是该病的高发区[3]。

目前，华支睾吸虫的研究主要集中在形态学、流行病学和病原鉴定等方面，而对华枝睾吸虫的群体遗传特征研究较少[4]。ITS序列存在于核糖体DNA(rDNA)中，它的进化速度快而且长度较小，协同进化使该片段在基因组不同单元间相对保守，因而适合采用分子技术来探讨科内属间及属下种间的遗传关系。本研究以采自东北7个不同地区的华支睾吸虫为研究对象，采用DNA序列分析方法对其ITS1基因的变异情况进行研究，以期鉴定华支睾吸虫科内属间及属下种间的遗传关系，并为进一步研究华支睾吸虫的起源、分类以及后睾科吸虫的系统发生关系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 虫株采自大庆、泰来地区的华支睾吸虫由黑龙江八一农垦大学寄生虫教研室惠赠；采自宾县、海伦、双城、同江和长春地区的华支睾吸虫由哈尔滨医科大学寄生虫教研室惠赠，经形态学鉴定为华支睾吸虫，并由本教研室保存。

1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒和胶回收试剂盒购自TIANEN公司；TaqDNA聚合酶、pMD18-T载体、EcoRⅠ和HindⅢ购自TaKaRa公司。

1.3 目的基因的扩增 取不同地区华支睾吸虫成虫各5条，按照DNA提取试剂盒说明提取DNA，-20℃保存。参考GenBank登录的韩国株华支睾吸虫(EU038128)ITS 5.8S和28S保守区序列，应用Primer 5.0软件设计扩增ITS1基因引物，上游引物为 5'-CCTGCGGAAGGATCATTAC-3'；下游引物为5'-ATCCACCGCTCAGAGTTGTAC-3'，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR扩增条件为：95℃10 min；94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 30 s，25个循环；72℃10 min。同时设不加DNA模板的阴性对照，PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4 ITS1基因的测序结果与序列分析 将纯化的PCR产物连接于pMD18-T载体中，转化DH5α感受态细胞内。筛选阳性重组菌，抽提重组质粒进行PCR鉴定和酶切鉴定(EcoRⅠ和HindⅢ)，重组质粒由上海生工生物工程技术服务有限公司测序。每个序列均经过正反链双向3次测定，以确保序列的准确性。应用DNAStar软件将DNA序列载入ClustalW1.83软件进行多序列比对，应用MEGA程序对系统进行初步进化分析，将本实验虫体的ITS1序列与GenBank登录的吸虫序列进行比对，用ClustalW软件进行排序，采用Phylip绘制系统进化树，NJ法构建系统进化树。

2 结果与讨论

2.1 ITS1序列的PCR扩增 宾县、大庆、海伦、双城、泰来、同江和长春源的7株华支睾吸虫成虫ITS1基因经PCR扩增，均可见约700 bp的条带(图1)，与预期目的片段(699 bp，其中包括5.8S部分序列17 bp、ITS1全序列661 bp、28S部分序列21 bp)相符，并且无非特异性条带。

2.2 各地区华支睾吸虫ITS1测序结果 测序结果表明，ITS1序列与预期结果一致。这7株华支睾吸虫ITS1序列扩增片段的大小均为661 bp，并且各测序结果碱基变异均小于6 bp。以宾县株序列作为参照对象，大庆株、海伦株、泰来株碱基突变均为T114A；海伦株、同江株碱基突变均为C293T；大庆株、海伦株、泰来株、同江株、长春株碱基突变均为C339T，大庆株碱基突变为T461A，大庆株碱基突变C615T。

2.3 序列分析 将测序获得的不同地区华支睾吸虫ITS1基因序列录入GenBank中，这7个序列登录号分别为：宾县株(CsBX)HQ186253、大庆株(CsDQ)HQ186254、海伦株(CsHL)HQ186255、双城株(CsSC)HQ186256、泰来株(CsTL)HQ186258、同江株(CsTJ)HQ186259和长春株(CsCC)HQ186260。

经DNAStar软件和DANMAN软件分析，ITS1序列的核苷酸同源性在99.4%～100%之间，遗传距离在0～0.006之间，宾县株与双城株、海伦株与泰来株、同江株与长春株序列核苷酸同源性均为100%。

将ITS1序列与GenBank登录的吸虫序列进行比对，用ClustalW软件进行排序，采用Phylip绘制系统进化树，NJ法构建系统进化树(图2)。

在吸虫的分类过程中，传统的分类方法是以形态、生活史、流行病学等特征对虫体进行鉴别分类，这种方法的优点是简单易行，但受各种因素的影响，很难准确的对吸虫进行分类。近年来，吸虫鉴别分类以DNA序列分析方法最为常见，该方法可准确地从基因水平上反应虫种的遗传信息，通过比较不同类群个体同源核酸的核苷酸排列顺序，研究样品的遗传变异水平[5]。在吸虫研究中，主要是通过核糖体和线粒体基因组中的部分序列进行分析，了解吸虫种间和种内遗传变异情况，明确其分类地位。

ITS1位于核糖体中18S与5.8S之间，从细菌、真菌到高等动、植物的18S、5.8S、28S的序列都是高度保守的；ITS序列的进化速度较快，而且在核基因组中是高度重复、而且不同ITS拷贝间的序列相近或完全一致，ITS的序列信息可以提供比较丰富的变异位点和信息位点。林瑞庆等对片形吸虫ITS1序列进行多态性研究结果显示，ITS1序列可作为遗传标记用于区分大片吸虫和肝片吸虫[5]。李利等提出黑龙江大庆地区牛源、绵羊源、绒山羊源和山羊源土耳其斯坦东毕吸虫的线粒体ITS基因可用于土耳其斯坦东毕吸虫分类及分子种系发生的研究[6]。

本研究通过对采自东北地区7个不同地域华支睾吸虫样品进行ITS1基因序列扩增，均得到661 bp的序列，产生变异的碱基数均小于6，同源性在99.4%～100%之间，遗传距离在0～0.006之间。用NJ法构建的系统发生树显示，分支情况与地区相隔远近成正相关，属于同域遗传，株特异性遗传标记，并没有因为生殖隔离而产生新的种群，没有发生同域物种形成的情况，但有不同程度的分化。广西株与其它区域华支睾吸虫所属分支相隔较远，韩国株与东北8个株相隔较近，这可能与生态环境和地理环境有关。广西属亚热带湿润季风气候，东北地区和韩国属温带大陆性气候。东北8个株自身差异较小，海伦株与泰来株，大庆株与沈阳株，长春株与同江株，双城株与宾县株位于同一分支。

本研究结果显示，ITS1片段可作为遗传标记用以鉴定华支睾吸虫科内属间遗传关系，还可以区分属下种间的遗传关系，本研究的结果对华支睾吸虫进一步的分类、鉴定、遗传变异研究、防治等都具有重要意义。

[1]Traub R J,Macaranas J,Mungthin M,et al.A new PCR-based approach indicates the range ofClonorchis sinensisnow extends to central Thailand[J].PLoS Negl Trop Dis,2009,3(1):e367.

[2]Kim E M,Kim J L,Sung Y C,et al.Infection status of freshwater fish with metacercariae ofClonorchis sinensisin Korea[J].Korean J Parasitol,2008,46(4):247-251.

[3]全国人体重要寄生虫病现状调查办公室.全国人体重要寄生虫病现状调查报告[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23(5)增刊：332-340.

[4]Neil D,Young B E,Campbell D,et al.Unlocking the transcriptomes of two carcinogenic parasites,Clonorchis sinensisand Opisthorchis viverrini[J].PLoS Negl Trop Dis,2010.4(6):e719.

[5]林瑞庆，董世娟，胥楚雄，等.片形吸虫第一内转录间隔区DNA多态性的研究[J].中国兽医科技，2004，34(7)：8-12.

[6]仇建华，李利，王春仁，等.牛羊源土耳其斯坦东毕吸虫ITS和28SrDNA-LSU序列分析[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2008，26(3)：183-186.