我国部分地区蛋鸡ALV-J分离株gp85基因遗传进化分析

潘 伟，高玉龙，刘超男，秦立廷，王永强，祁小乐，高宏雷，王笑梅

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

J亚群禽白血病病毒(Subgroup J of avian leukosis virus，ALV-J)最初由Payne从肉用型鸡中分离鉴定[1]，该病毒的前病毒基因组具有典型C型反转录病毒基因结构特点，即 5'LTR、gag、pol、env、3'LTR。其中，不同病毒株间gag和pol基因非常保守，而env基因则发生了较大的变异[2-4]。env基因的变异主要出现gp85的编码区。gp85蛋白的变异主要发生在第40 aa～70 aa、115 aa～120 aa、180 aa～220 aa等处。研究表明有些位点的改变可能导致疏水性显著变化，从而引起抗原性发生显著变化[5]。

2009年至2010年，我国部分地区蛋鸡群中爆发J亚群禽白血病[6]，给我国蛋鸡业造成了很大的经济损失。为了解这些地区蛋鸡ALV-J流行株的来源及进化关系，本研究对2009年以来从国内6个省区蛋鸡场中分离到的19个ALV-J分离株的gp85基因进行了克隆测序，并与其他来源的11株ALV-J作了比较分析。

1 材料和方法

1.1 病毒分离株 19个蛋鸡ALV-J分离株均为本实验室于2009年～2010年间分离自我国部分地区(表1)。用于比对分析的其他病毒株序列来自Gen-Bank，分别为国际参考株4817(AF247385)、ADOL-7501(AY027920)、ADOL-Hc1(AF097731)、HPRS-103(Z46390)、国内分离自海兰灰蛋鸡的参考病毒株SD07LK1(EU264064)、麻黄肉种鸡株 SCAU-0901(FJ619190)与白羽肉鸡的参考病毒株NX0101(AY897227)、HN0001(AY897219)、YZ9901(AY897222)、SD0002(AY897224)和 SD0101(AY897220)。

表1 蛋鸡ALV-J分离株的地理分布及分离年代Table 1 The area distribution and isolated year of relative ALV-J isolates

1.2 主要试剂 ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker和pMD18-T均购自TaKaRa公司；Plasmid Miniprep Kit和 DNA Gel Extraction Kit为AxyGen产品。

1.3 前病毒DNA的提取 将这19个ALV-J分离株分别感染后检测为阳性的DF-1细胞，反复冻融3次后，分别取100 μL细胞上清，按照常规方法提取DNA：取病料研磨液100 μL，加入裂解液裂解后，静止5 min～10 min；酚/氯仿/异戊醇抽提，RNA酶消化后，-20℃保存备用。

1.4 gp85基因的克隆和测序 以ALV-J原型株HPRS-103为参考株(Z46390)，设计合成用于扩增各病毒株gp85基因的引物。上游引物为：5'-GGAGTT CATCTATTGCAACAACC-3'；下游引物为：5'-GCG CCTGCTACGGTGGT-3'，引物由上海Invitrogen公司合成。预期扩增片段长度为924 bp。参照ExTaq试剂反应体系对该病毒株gp85基因进行扩增，PCR产物回收后克隆入pMD18-T中，转化DH5α感受态、筛选和鉴定，每个片段选3个以上阳性克隆由上海Invitrogen公司测序。

1.5 序列分析 采用DNAStar中SeqMan软件对测序结果进行剪辑、拼接，并将各ALV-Jgp85基因序列与GenBank中的11株ALV-J序列进行比较分析。

2 结果与讨论

2.1 各分离株gp85基因的PCR结果 以各ALV-J病毒株感染DF-1细胞，以提取细胞基因组DNA为模板进行PCR，结果扩增出了约900 bp特异性条带，与已知阳性对照组HPRS-103的PCR结果一致。而对照DF-1细胞提取的基因组DNA扩增结果为阴性(图 1)。

2.2 各分离株gp85推导氨基酸序列与参考病毒株的同源性比较 19个蛋鸡ALV-J分离株的gp85基因ORF全长不等，为894 bp～924 bp，分别编码298～308个氨基酸，其推导氨基酸序列同源性为80.9%～100%。其中，A组(HB09JY04株、HLJ09MDJ-1株与 SD09WF03株)间以及 B组间(JL09DHS8株、JL09JL2-1株与JL0904株)氨基酸序列同源性均达到100%，表明它们可能分别源自同一病毒株。而JL09DH02株与其他分离株的同源性仅为80.9%～88.3%，表明该病毒株gp85基因发生了较大变异。gp85基因比较表明，不同地区流行株不存在地域性差异，而是许多病毒株的混合感染，给该病的诊断和防制带来很大困难。

将19个分离株与4株国际参考株(HPRS-103、ADOL-7501、4817、ADOL-Hcl)的gp85基因氨基酸同源性进行比较分析结果表明，它们与4株国际参考株之间的同源性平均为83.4%(68.7%～98.1%)。其中，这19个分离株与原型株HPRS-103的同源性最高，平均为87.0%(75.9%～98.1%)，与美国肉鸡株ADOL-7501的平均同源性最低，仅为75.0%(68.7%～87.3%)。这些数据表明，19个分离株gp85基因发生了较大变异，但相对美国ALV-J株，这些病毒株与HPRS-103株亲缘关系更近。

19个分离株与来自白羽肉鸡的5株国内参考株gp85氨基酸同源性平均为83.2%(71.9%～94.5%)。其中，19个分离株与SD0002、SD0101的同源性最高，平均为83.1%(71.9%～94.2%)，而与NX0101的同源性最低，平均为81.8%(730%～90.6%)。这提示目前蛋鸡ALV-J分离株与国内肉鸡分离株gp85基因存在差异。

而19个分离株与来自国内早期蛋鸡的SD07LK1株同源性平均为 82.1%(72.6%～91.6%)。这表明，虽然同是国内蛋鸡分离株，但这19株蛋鸡分离株ALV-Jgp85基因却与国内早期蛋鸡ALV-J存在很大的差异。

2.3 各分离株gp85推导氨基酸与参考病毒株的遗传进化树分析 采用DNAStar MegAlign绘制遗传进化树(图2)。结果显示，本研究中19个分离株在进化树中大致可归类为3个分支。其中，HB09XZ01株、SD09TA04株、HB09JY03株、SD09WF03株、GD09FS05株、SD09JY04株、SD09WF01株、HB09JY04株、HLJ09MDJ-1株、JL09DHS8株、JL09JL2-1株、JL0904株、HB09XT02株与原型株HPRS-103亲缘关系较近，并且SD09TA02株与HPRS-103株的亲缘关系最近。此外，这13个分离株也与国内分离自麻黄肉种鸡株SCAU-0901属于同一分支，表明它们与SCAU-0901株的关系较近。

SD09DP03、SD09DP04、HLJ09BL株则与美国株ADOL-7501株、国内肉鸡中分离的HN0001株的亲缘关系较近。而JL0903、HF0812、JL09DH02株则处在独立分支，表明它们的gp85基因发生了很大变异。

值得注意的是，各分离株与美国白羽肉鸡中分离的ADOL-Hcl、4817、国内早期白羽肉鸡株NX0101、SD0101、YZ9901、SD0002及蛋鸡株SD07LK1株处在不同分支，表明它们之间的亲缘关系较远，提示国内当前蛋鸡株可能并非源自国内早期肉鸡株，其来源有待进一步研究。

本研究表明，从gp85基因方面分析，我国部分省区蛋鸡群中ALV-J流行株大多与英国原型株HPRS-103亲缘关系较近，但其同源性相比早期病毒株已经有所降低。更多变异病毒株出现在蛋鸡群中，而变异病毒株对蛋鸡致病性是否发生改变则应引起高度重视。

[1]Payne L N,Brown S R,Bumsted N,et al.A novel subgroup of exogenous avian leucosis virus in chickens[J].J Gen Virol,1991,72(4):801-807.

[2]杜岩，崔治中，秦爱建，等.鸡的J亚群白血病病毒的分离及部分序列分析[J].病毒学报，2000，4：341-346.

[3]刘超男，高玉龙，高宏雷，等.J亚群与E亚群禽白血病自然重组病毒的全基因组序列分析[J].中国预防兽医学报，2009，31(12)：978-981.

[4]Venugoal K,Smith L M,Howes K,et al.Antigenic variants of J subgroup avian leucosis virus:sequence analysis reveals multiple changes inenvgene[J].J Gen Virol,1998,79:757-766.

[5]Silva R F,Fadly A M,Hunt H D.Hypervariability in the envelope gene of subgroup J avian leucosis virus obtained from different farms in the United States[J].Viology,2000,272:106-111.

[6]高玉龙，邵华斌，罗青平，等.2009年我国部分地区禽白血病分子流行病学调查[J].中国预防兽医学报，2010，32(1)：32-35.