一株野鸭源基因III型新城疫病毒主要生物学特性及基因组序列测定分析

石 跃，刘怀然，刘培欣，李东伟，杨 煦，华育平，孔宪刚*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/禽传染病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001；2.东北林业大学野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150025)

新城疫(Newcastle disease，ND)是由 ND病毒(NDV)引起，主要危害家禽的一种急性、高度接触性传染病[1]。我国对ND的防控采用的是严格的疫苗免疫，已经基本上控制了ND的流行，但与此同时来自疫苗的免疫压力和宿主的选择压力也加速了NDV的变异。近年来不断有高水平免疫鸡群发生病例，以及NDV感染家养水禽鸭、鹅发病的报道。野生水禽被认为是NDV的天然宿主，体内多携带对鸡无致病性的NDV弱毒株，但有证据表明家禽爆发ND与持续存在于野鸟体内的NDV有关[2]。本研究对从黑龙江地区获得的一株野鸭源NDV分离株进行生物学特性鉴定，表明该病毒株的ICPI值达到强毒株的标准，而基因组测序结果显示它与疫苗株Mukteswar同源性很高。本研究为进一步了解野鸟源病毒株与疫苗株的潜在关系提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要材料 NDV Mallard/CH/HLJ383/06(简称WB383)，分离于2006年采自黑龙江三江自然保护区野生绿头鸭泄殖腔拭子，拭子样品由东北林业大学提供；9日龄～10日龄SPF鸡胚、1日龄及15日龄SPF鸡均由哈尔滨兽医研究所实验动物中心提供；NDV标准强毒株(F48E9)阳性血清、DH5α感受态细胞由本实验室保存；TRIzol reagent购自Invitrogen公司；M-MLV购自MBI Fermentas公司；ExTaq、dNTP、pMD18-T均购自TaKaRa公司；DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.2 病毒纯化及F基因扩增 鉴定为阳性的NDV按常规方法在鸡胚成纤维细胞(CEF)上进行蚀斑纯化[3]。用引物P4358(5'-GCCATTGCCTAAATACAAT CC-3')和引物 P6031(5'-GGCTCCTCTTACCGTTCTA C-3')扩增全长F基因，克隆至pMD18-T载体中，进行序列测定。参照GenBank登录的NDV各参考病毒株F基因序列构建F基因遗传进化树。

1.3 1日龄雏鸡脑内致病指数(ICPI)测定 将蚀斑纯化的NDV分离株按照OIE方法进行1日龄雏鸡ICPI的测定，共测定两次。

1.4 15日龄SPF鸡致病性试验 取10只15日龄SPF鸡，以103TCID50/0.1 mL剂量通过滴鼻点眼方式接种WB383分离株，隔离器饲养3周，记录SPF鸡的发病和死亡情况，接种5 d后取3只鸡剖检，观察病变情况，并检测存活鸡的血清抗体效价。

1.5 病毒全基因组序列测定与分析 根据WB383分离株F基因序列分析结果，参照GenBank登录的Mukaswar株序列(EF201805)，设计11对引物用于扩增WB383病毒基因组全长，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(如果需要引物序列作者可以提供)。扩增片段克隆至pMD18-T载体中，由北京六合华大基因公司进行序列测定。

2 结果与讨论

2.1 F基因进化分析 自野生绿头鸭的泄殖腔拭子分离出一株具有血凝性病毒，经血凝抑制试验鉴定为NDV，命名为Mallard/CH/HLJ383/06，简称WB383。RT-PCR扩增其F基因核苷酸序列，将其测序结果与NDV参考株进行比较，结果表明WB383株与Mukteswar同源性最高为99.9%，属于ClassⅡ的基因Ⅲ型(图 1)。

2.2 致病性试验 对WB383分离株进行的两次ICPI指数测定平均值为1.81，明显高于NDV中等毒力病毒株判断标准(ICPI<1.50)(表1)。结果表明，与最近报道的江苏分离株鉴定结果相似，基因Ⅲ型病毒株ICPI值均有所升高[10]，接近近年来我国流行的基因Ⅶ型NDV的ICPI值水平。15日龄SPF鸡致病性实验结果显示接种3 d后，均出现临床发病症状，无死亡病例。接种后5 d，剖检可见2/3鸡腺胃壁变薄，乳头覆盖大量粘液，乳头突起不明显，无出血现象；接种后14 d，血清抗体血凝抑制效价达到1∶25～1∶28，表明它对于15日龄SPF鸡的致病力仍低于同水平ICPI值的基因VII型NDV株[4]。以上试验结果表明，虽然野鸟源病毒株WB383的ICPI值已达到强毒株判断标准，但仍属于基因Ⅲ型中发型病毒株，致病性的改变也许正处于一个动态的过程中，有潜在引起鸡群发病的可能。

表1 Mallard/CH/HLJ383/06与其他NDV毒株的ICPI值比较Table 1 ICPI value comparision of Mallard/CH/HLJ383/06 with other NDV strains

2.3 全基因序列比较 通过RT-PCR扩增出11条目的片段，测序后通过DNAStar软件进行拼接。结果表明，WB383病毒株的基因组全长为15186 nt，长度与基因Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅳ型等较古老的基因型NDV株相同，基因组长度符合“6的整数倍”原则[5]。在GenBank登录的NDV全长序列中，WB383与Mukteswar株、JS/705/Ch株、JS/9/05/Go株同源性最高，核苷酸同源性高达99%以上，结构蛋白氨基酸同源性为99.0%～99.7%。

NDV F蛋白裂解位点的氨基酸序列是决定病毒毒力主要因素之一，强毒株在该位点的氨基酸基序为112R/KRQK/RRF117，而弱毒株基序则为112G/EK/RQG/ERL117。HN蛋白具有受体识别和神经氨酸酶的作用，与病毒的嗜性相关，也是NDV重要的毒力相关因子之一[6]。近年来，随着NDV反向遗传操作系统的建立和应用，研究表明除了F和HN基因外，其他几个基因也与NDV毒力相关[7]。Rout等研究表明NDV的L蛋白通过影响病毒的复制水平影响病毒的毒力，所以该蛋白的变化对NDV毒力演化的作用很关键[8]。

Mukteswar病毒株是从印度分离强毒株经鸡胚致弱多代获得的，是我国Ⅰ系疫苗株的原始病毒株[9]。鸡源JS/7/05/Ch株和鹅源JS/9/05/Go株与疫苗株Mukteswar同源性最高，但它们的ICPI值却高于Mukteswa株，同时由于我国一直没有基因Ⅲ型强毒NDV流行的报道，偶尔分离到的基因Ⅲ型病毒株与Mukteswar具有很高的同源性，由此推测这两株分离株很可能是疫苗株Mukteswar的返强病毒株[10]。

WB383与Mukteswar全基因组序列间核苷酸同源性高达99.8%，共有33个核苷酸差异，导致16个氨基酸突变，低于JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go变异的25个氨基酸。WB383株与Mukteswar株相比变异的16个氨基酸中，有9处氨基酸变异为WB383株所独有，而Mukteswar与JS/7/05/Ch、JS/9/05/Go株在此处相同(表2)。分析这4株病毒的结构蛋白，F蛋白差别最小，WB383、JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go与疫苗株Mukteswar的F蛋白仅在氨基酸203位发生A-T的一致性变异；HN蛋白同源性差别最大，在0.7%～1.8%之间且变异的15处氨基酸位点均不相同，这可能主要与3株病毒分离自不同的宿主有关；L蛋白发生氨基酸变异的点也较多，WB383株与Mukteswar株相比较有5处变异，JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go均为13处变异。相对于Mukteswar疫苗株，WB383、JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go株有4处一致性氨基酸变异。虽然3株病毒的主要毒力因子F和HN蛋白的氨基酸残基相比于Mukteswar株都发生了改变，但是三者发生一致性突变的位点却多集中在L基因上。据此，我们推测WB383株与JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go分离株一样可能为疫苗株Mukteswar在不同宿主体内进化而来，由于宿主或免疫压力而发生变异，这些变异以点突变为主，积累到一定程度引起致病性的改变。至于HN蛋白及L蛋白的氨基酸点变异是否与病毒嗜性、毒力是否相关，尚需进一步验证。

表2 Mukteswar株与WB383、JS/7/05/Ch和JS/9/05/Go蛋白变异位点Table 2 Protein and mutation site of NDV strains Mukteswar and WB383,JS/7/05/CH,JS/9/05/Go

综上所述，自不同地区(江苏，黑龙江)及不同禽源(鸡、野鸭、鹅)均分离到与疫苗株同源病毒株，而且毒力升高或具有升高趋势，表明NDV可以在鸡群-家养水禽-野生水禽间传播而形成一个天然的NDV循环库，并在宿主选择压力及其它因素作用下发生变异，进而导致宿主嗜性及致病性改变。现阶段应扩大NDV流行病学监测范围，加强对野鸟特别是野生水禽的NDV流行病学监测，为ND防控和新型疫苗研制提供数据。

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