麻鸭白细胞介素17的原核表达及鉴定

2011-05-21潘志明耿士忠康喜龙丛秋霞焦新安

中国预防兽医学报 2011年5期

赵雯，潘志明，耿士忠，康喜龙，方强，丛秋霞，焦新安

(扬州大学江苏省人兽共患病学重点实验室，江苏扬州 225009)

白细胞介素(Interleukin，IL-17)是一种由效应T细胞产生的细胞因子，可刺激成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和上皮细胞产生前炎性细胞因子，包括IL-1、IL-6、TNF-α和趋化因子等，最终诱导炎症反应[1]。2009年Yoo等首先克隆出雌性樱桃谷北京鸭的 IL-17基因(duIL-17)，其序列与鸡 IL-17(chIL-17)和哺乳动物IL-17氨基酸同源性分别为84%和37%[2]，这表明家禽IL-17既具有一定的保守性，又各自具有种属特异性。另外，目前尚未有duIL-17检测试剂的研究报道。为此，本研究克隆我国地方品种麻鸭的IL-17基因，并且进行了原核表达，在此基础上探讨了表达产物的免疫反应性，为duIL-17单克隆抗体的制备提供条件。

1 材料和方法

1.1 实验材料 pGEX-6P-1、DH5α和BL21均由江苏省人兽共患病学重点实验室保存；限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ、高保真TaqDNA聚合酶、pCR2.1载体、T4 DNA连接酶、DNA回收试剂盒和RNA提取试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)购自Promega公司；酵母抽提物和蛋白胨购自Oxoid公司；ConA、HRP标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司；小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司；麻鸭购自扬州某种鸭场；鼠抗鸡IL-17多克隆抗体(ELISA效价1∶12800)由本实验室制备。

1.2 引物的设计与合成根据GenBank中登录的17 mRNA序列(EU366165.1)，设计合成一对用于PCR扩增IL-17基因的的引物。上游引物：5'-TAGG ATCCATGTCTCCAACCCTTCGTGCTT-3'；下游引物：5'-TAGTCGACTTGCTCTTGCACCACAGGCTCC-3'。下划线分别为BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点序列。预期扩增出的目的条带大小为534 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 脾脏淋巴细胞的分离取麻鸭脾脏，将其制成单细胞悬液，分离其中淋巴细胞，将细胞加至24孔培养板中，1×107个/孔，每孔再加入5 μL ConA(500 mg/L)，于5%CO241℃培养。

1.4 细胞总RNA的提取及反转录上述细胞培养48 h后收集细胞，加入细胞裂解液，按试剂盒步骤提取总RNA。反转录体系如下：总RNA 5 μL、5×buffer 2 μL、Enzyme Mix 0.5 μL、Oligo(dT)Primer 0.5 μL、Random 6 Primer 0.5 μL、RNase Free H2O 1.5 μL，总体积 10 μL，37 ℃ 15 min，85 ℃灭活反转录酶5 s。cDNA用于PCR扩增反应。

1.5 duIL-17基因的扩增及表达载体构建以反转录cDNA为模板，PCR扩增约534 bp的IL-17基因片段。PCR反应条件为：95℃ 5 min；94℃ 40 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，30个循环；72℃ 5 min。将PCR产物与pCR2.1载体连接，构建重组质粒pCR2.1-duIL17，将重组质粒转化DH5α感受态，提取质粒后用BamHⅠ和SalⅠ双酶切，鉴定正确的重组质粒由南京金斯瑞生物科技有限公司进行测序。抽提pCR2.1-duIL17，经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后回收目的片段，与pGEX-6P-1载体相连接，连接产物转化DH5α感受态，将重组质粒进行酶切鉴定，并由南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序正确的重组质粒命名为pGEX-duIL17。

1.6 duIL-17的诱导表达及鉴定将pGEX-duIL17转化表达菌BL21，经抗性筛选后，挑取单个克隆扩增后进行PCR鉴定。以0.5 mmol/L IPTG进行诱导表达。裂解诱导产物，离心分别取上清和沉淀。将诱导产物、诱导产物裂解上清和沉淀进行SDSPAGE 分析[3]。

1.7 Western blot分析将诱导的重组菌和非重组菌经SDS-PAGE电泳后，将蛋白转印到PVDF膜上，用含100 mL/L小牛血清的PBST 4℃作用；以鼠抗鸡IL-17抗体作为一抗(1∶2000稀释)，作用2 h；充分洗涤后以羊抗鼠HRP-IgG作为二抗(1∶1000稀释)作用1 h，PBST洗涤5次后，DAB显色，蒸馏水终止反应。

2 结果与讨论

经PCR扩增获得约500 bp大小的目的片段，而且无非特异性条带(图1)。将测序结果与GenBank中登录的序列(EU366165.1)相比对，结果显示第174位碱基由C突变为T，并且为沉默突变。将PCR产物及pGEX-6P-1载体用BamHⅠ和SalⅠ进行双酶切，回收后连接，获得重组质粒pGEX-duIL17。重组质粒再经BamHⅠ和SalⅠ双酶切后电泳，出现约500 bp的插入片段和4900 bp的载体片段，与预期结果相符，表明IL-17基因已被正确插入到表达载体pGEX-6P-1中。将重组原核表达质粒pGEX-duIL17转化表达菌BL21，以质粒为模板，PCR扩增duIL-17基因片段，出现约500 bp的条带，与预期结果相符，证明重组原核表达质粒pGEX-duIL17已成功导入宿主菌BL21。

挑取重组菌pGEX-duIL17/BL21经IPTG诱导表达，诱导产物经SDS-PAGE分析，结果表明duIL-17基因在大肠杆菌中获得表达，重组蛋白分子量约为45 ku(图2)，而且重组蛋白主要以包涵体形式存在。Western blot试验结果表明，鼠抗鸡IL-17抗体能够识别经IPTG诱导表达的重组菌在45 ku位置的特异性条带，这与表达的重组蛋白GST-duIL17的大小相符(图3)，表明重组蛋白能够被鼠抗鸡IL-17抗体识别。

本研究中克隆的麻鸭duIL-17基因，与Yoo等克隆的樱桃谷北京鸭IL-17基因相比较，其核苷酸和氨基酸的同源性均为96.8%，显示IL-17基因在相同种属间的同源性很高[2]。目前尚缺少有关鸭IL-17方面的检测试剂，本研究则为duIL-17单克隆抗体的研制提供了有用的实验材料。