细菌“活的非可培养状态”核酸检测方法

李 影，王伟利，钱爱东*

(1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118；2.吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，吉林 长春 130062)

自1982年，细菌活的非可培养状态(Viable but nonculturable state，VBNC)被正式提出至今其研究的实际意义越来越明显，特别是在食品检疫、水质监测等方面尤为突出。随着研究不断深入，用于VBNC细菌检测的技术种类也越来越多，如基于底物吸收能力的Fouge活菌直接计数法、氧化还原能力的呼吸检测法、细胞质膜结构完整性的活/死细菌试剂盒检测法以及其核酸的核酸方法等[1]。然而，由于目前“活细胞”的标准尚未得到充分证明和有效认可，使得这些方法均有一定的适用范围和局限，也均存在着一定的问题和不足。相比之下，基于核酸的分子生物学技术在近几年发展迅速，众多处于VBNC状态下的细菌得以准确而快速检出。并且在该技术推动之下，有关VBNC状态的分子发生机制也得以明确阐述。为此，本文从使用范围、适用条件、优缺点及应用等几方面，对目前在VBNC研究领域中广泛应用的核酸检测技术进行评述。

1 VBNC细菌核酸检测方法建立的前提-确定“活细胞”分子

检测VBNC细菌时，确定“活细胞”的标志是至关重要的。只有那些可培养细胞数为零而活细胞数不为零的细菌才有可能具有VBNC状态。可培养数的测定依照平板计数法便可完成，但要确定“活细胞”数，就必须分清具备了何种特性的细胞才算是“活细胞”。在以往研究中，一般认为：能够保持细胞结构完整(如细胞膜完整)、具有代谢活性(如呼吸运动、吸收生化物质等)或者能合成DNA、存在mRNA分子以及VBNC特异性基因等，只要能满足其中一个标准的细胞即可判定为“活细胞”[2]。显然，在建立VBNC细菌核酸检测方法时，RNA或DNA理应是最能代表细胞活性状态的首选分子。然而，以检测DNA为基础的方法尽管特异性较高且简便省时，但由于DNA分子在死细胞中可长久存在，其检测的假阳性率也较高。相比之下，以RNA分子，尤其是以mRNA分子为基础的检测技术是公认的活细胞的信号分子，可排除假阳性的干扰，但由于mRNA分子在VBNC细菌中的丰度偏低，往往有些细菌因转录不活跃而无法得到有效检出，而且mRNA不稳定，易被核酸酶快速降解，因此该方法的敏感性与特异性均较低[3]。随着分子生物技术的发展，无论是以DNA还是以RNA为主建立的VBNC检测技术，其技术缺憾正得到有效弥补和改进，而“活细胞”的判定标准也正必将会被规范得客观而精准。

2 VBNC细菌核酸检测方法建立的关键-确定VBNC发生相关基因

大量研究均已表明，与VBNC发生相关的基因是一组基因群，这组基因群因诱导因素的(温度、营养、pH值、药物等等)不同而启动不同的基因，并且不同菌的VBNC发生相关基因群亦不相同[4-6]。我们在研究大肠杆菌、沙门氏菌VBNC发生相关基因时，亦得出同样结论[7-8]。因而，以PCR技术作为支撑来检测VBNC细菌的策略便是：在充分比较与筛选的基础上，确定某几个基因为VBNC特异性基因之后，再依据基因设计特异性引物并建立PCR或RT-PCR方法。获取特异性基因最直接简便的方法便是参考和借鉴文献资料，否则依据突变体或采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)、消减杂交(SH)、随机捕获转录序列(SCOTS)、双向蛋白质凝胶电泳、基因芯片等确定VBNC发生相关基因，将是难度高、工作量极大的工作[9]。但是随着研究的不断深入，利用上述研究技术使得某些细菌(如霍乱弧菌)VBNC发生相关基因及作用机制得以明确阐述。Abe等利用一种烷化突变剂NTG对霍乱弧菌进行诱变，经低温及寡营养条件诱导后，获得了VBNC突变株。该突变株具备了在平板上生长繁殖能力，并与正常菌株经抑制性消减杂交(SSH)后，最终确定了谷胱苷肽转移酶基因为VBNC发生相关基因，由此亦证明了增加谷胱苷肽可延长正常菌的可培养性[4]。Lai等则利用蛋白质双向凝胶电泳获得了副溶血弧菌ST550株VBNC状态蛋白质表达谱，发现有13种蛋白质负责诱导和维持VBNC状态，这些蛋白质与DNA指导的RNA聚合酶、ATP合成酶等密切相关，而相关的决定基因也被证实[5]。由此表明，目前确定VBNC相关基因的最常用方法和策略，便是选择具有生物学特征并且功能明确的已知基因作为目标基因，根据目标基因在可培养与VBNC状态下所呈现的变化或发挥的作用进行差异筛选，最终确定只能在VBNC状态起作用的基因为VBNC相关基因。

3 基于DNA分子的VBNC细菌PCR检测方法

该方法优点主要表现在：VBNC细菌基因组DNA易提取，而且不易受到外界影响而降解。PCR技术快速、灵敏、特异，并且操作简便省时[10]。而在实际应用中，该法一个最大的缺憾便是难以排除假阳性的干扰。针对这种缺憾，一些新改进技术也应运而生，如浮选法、增养法等。这些技术均是借鉴了环境微生物富集模式，或者以增加培养等方式刺激活细胞中DNA充分活跃地复制，以此降低死细胞中DNA分子的浓度，将假阳性降至最低，同时又能避免假阴性结果的出现。但对VBNC细菌而言，DNA复制已经减弱，因此培养法不适用于VBNC细菌研究。目前浮选PCR技术已在肉品中小肠结肠炎耶尔森菌[11]和空肠弯曲杆菌[12]VBNC状态检测时得到很好应用，尚不具有普遍性。只有目标菌的浮力密度数值范围适当，该法才可适用。该方法的原理主要是依据样品中(包括VBNC等活细胞、死细胞、游离的DNA分子及样品杂质等)不同状态细胞的浮力密度值，用3种标准浮值溶液对样品进行前处理并确定各类细胞的浮值数值。然后再利用密度梯度离心将不同状态细胞分离。由于细胞死亡时浮值增加，远大于VBNC等活细胞，浮于溶液最上层[12]。而VBNC细胞则处于中间层，样品中的杂质处于底层。此外，游离的DNA分子由于沉降速度较慢难以达到中间层，因而也停留于上层。获取VBNC等活细胞后，再采用定量PCR或即时PCR检测。实践证明，该法的优点就是能够有效地区分活的和死的细胞，将死细胞及游离的DNA分子从检测体系中清除，避免了PCR反应的假阳性。同时VBNC等活细胞又得到富集，从而克服了反应的假阴性。另外，该技术可间接地起到纯化DNA作用，排除了样品杂质等抑制PCR反应的因素，使检测方法的灵敏度和特异性得到大幅提升，并且缩短了检出时间。一般在2个小时内便可完成食品中VBNC细菌的检测。

4 基于mRNA分子的VBNC细菌PCR检测方法

在不同类型的RNA分子中，rRNA和mRNA现已被认为活细胞的标志分子。作为标志，mRNA的优点在于其稳定性差，在细胞易被降解，并且半衰期短，能比较客观地评价和指示细胞的活性状态。但在某些情况，VBNC状态下的mRNA丰度极低，不易被检出，而存在假阴性反应。相比之下，rRNA分子在细胞中丰度高，半衰期较长，往往可在死细胞中存留较长时间。尽管能保证检测的灵敏性，但假阳性反应却无法消除。目前，在VBNC研究领域中，基于rRNA分子的检测方法主要是DVC-FISH法，即活细胞直接计数与荧光原位杂交联合技术。该法已在大肠杆菌[13]、幽门螺杆菌[14]等细菌的VBNC状态检测中得到应用，但该方法在实际使用时存在如下问题：(1)适用范围窄。因为DVC法所用的萘啶酮酸仅对G-菌DNA复制有抑制作用，而对G+菌无作用。(2)存在较高的假阳性反应，这是方法难以克服的瓶颈问题。由于rRNA分子在死细胞中也会存在，但目前尚无有效克服或排除假阴性的方法。(3)荧光原位杂交(FISH)固定时往往会对活细胞膜有破坏作用，因而不易于准确区分活/死细胞[15]。与之相比，尽管mRNA在VBNC细菌中不稳定，丰度低，但是基于mRNA分子的RT-PCR技术却已在实际中得到一定应用。Narjol等在利用定量RT-PCR评价霍乱弧菌E13083株的tuf、rpoS和relA基因在VBNC状态下表达量时证实，VBNC细胞的tuf、rpoS和relA基因表达量分别是对数期细胞的5500、24和23倍，可用该方法直接检出VBNC状态下的霍乱弧菌[16]。Coutard等则利用RT-PCR技术分析了处于VBNC状态的霍乱弧菌Vp4株的两种看家基因16S RNA和23S RNA、两个毒力基因tdh1和tdh2以及rpoS基因，证明16S RNA、23S RNA和rpoS是区别可培养状态与VBNC状态的活细胞标志，而tdh1和tdh2基因在VBNC阶段则不表达[17]。

5 VBNC细菌基因芯片检测方法

基因芯片是生物高通量检测技术的最典型代表，不但可以直接用于VBNC细菌检测，而且还可以充分了解VBNC状态下的基因谱和表达谱，便于建立RT-PCR方法和了解VBNC分子作用机制。Gary等设计了可检测来自O1型霍乱弧菌基因组DNA上的3707个基因的cDNA芯片，并全面比较分析了VBNC与稳定期条件下霍乱弧菌的基因转录情况。经检测，在VBNC状态下总共有100个基因被启动诱导，并经定量RT-PCR证实，VC0230[iron(III)ABC transporter]，VC1212(pol)，VC2132(fliG)和VC2187(flaC)等4个基因可作为霍乱弧菌VBNC发生相关的特异性基因，可直接用于检测，即当应用该芯片检测时，当上述4个基因出现阳性信号，则表明样品中存在VBNC细胞[18]。Asakura等设计合成了95个寡核苷酸探针，每个探针均为34～70个不等的多聚体。该芯片除具有种特异性外，还对来自4种霍乱弧菌的毒力、耐药性、血清型，以及VBNC状态进行同时检测。在利用芯片检测VBNC细胞时，首先比较了经4℃人工海水诱导157 d、76 d和35 d的VBNC细胞与可培养状态下正常细胞的mRNA基因表达谱，结果充分证实了两种状态的差异，可以明显区分两个状态，便于VBNC细菌检测[19]。Liu等根据17株大肠杆菌的17个rfbE基因和28株大肠杆菌的28个fliC基因序列设计特异性探针，并研制出了电子芯片。该芯片可以在1L自然水体中检出VBNC大肠杆菌O157∶H7细胞的最小数为50个。并经RT-PCR共同证实，rfbE和fliC基因是大肠杆菌O157∶H7的VBNC特异性基因，因而该电子芯片可作为自然水体样品中VBNC大肠杆菌O157∶H7的定量定性分析工具，并且重复分析使用5次[20-21]。由此表明，VBNC细菌基因芯片检测方法不但具有高通量、灵敏、特异、快速、准确，而且还利于VBNC发生机制研究。但VBNC细菌基因芯片研发成本昂贵，并且因细菌RNA不稳定极易导致检测结果重复性较差。尽管如此，基因芯片作为一个具有良好发展前景的技术，必将在未来VBNC细菌检测中得到更广泛地应用[22-23]。

6 结语

针对活细胞分子的各类检测技术是建立VBNC细菌检测方法的前提，但并非所活细胞检测方法都适用VBNC细菌。因此，在建立VBNC细菌检测法时，尚需在确定活细胞分子标志后，再确定活细胞基因，并且该基因应为VBNC状态所表现的相关基因而非可培养状态下启动的基因，也就是说应为能代表和体现VBNC状态的特异性活细胞基因。综上所述，建立VBNC细菌核酸检测方法的总体思路为：首先，确定待检菌是否具有培养能力；其次，利用Live/Dead试剂确定待检菌的细胞活性；再次，选定待检的活细胞分子和待检菌的VBNC状态的特异性活细胞基因；最后，基于DNA或mRNA分子，与VBNC发生相关基因共建核酸检测方法。

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