纺锤体毒物检测新方法的建立和应用

郑 璐，王 琼

纺锤体毒物（SP）是一种非遗传毒物，其作用终点并不是遗传物质本身，而是细胞分裂中的纺锤体[1]。因而SP不能被现行的基因突变、染色体畸变试验检出，但SP与一般诱变剂的效应是相同的，最终会引发癌变等严重后果。由此，笔者根据SP的作用终点及其诱变效应，经过反复优化，建立了检测SP的不同实验方法。根据国内外文献报道，选择了偏二甲基肼、雌二醇、利血平、糖精、石棉、秋水仙碱为被检物，它们均有确定的致癌性，但它们的短期致突变试验均未获得满意的结果[2-4]。应用新建立的方法对其诱变活性进行了检测，证明该方法灵敏可靠，从而为防止SP漏检提供了实用、有效的检测手段。现将检测工作报告如下。

1 纺锤体形态损伤的直接观察

首先，借鉴国外先进的经验摸索建立了分化染色技术[5，6]。该技术方法的创新点是用番红和灿烂蓝复合染液将有丝分裂细胞的染色体、细胞质、纺锤丝染成不同颜色，这样在一个完整的细胞中同时显示纺锤体和与之相连的染色体。用这种方法能较容易地分析大量的有丝分裂细胞，使得直接观察纺锤体形态及损伤成为可能。应用该技术方法对所选择的6种被检物进行了检测，随着培养液中浓度的增加，各种形态异常的纺锤体明显增加，呈现良好的剂量效应关系。高染毒量完全破坏了纺锤体结构。

2 诱发非整倍体的检测

纺锤体损伤必然导致整条染色体丢失或增加，即诱发非整倍体。笔者用3种实验方法对其进行了检测。

2.1 完整中期细胞染色体计数法 这是根据非整倍体的定义而设计的。该方法的创新点之一：检测目的性十分明确，通过直接计数染色体数目的变化来反映SP诱发非整倍体的活性。创新点之二：常规中期相标本制备中，低渗处理较强，破坏了细胞膜，造成染色体人为丢失。为了避免这种人为误差，笔者采用了减弱低渗处理的实验条件。对低渗浓度和处理时间进行了反复摸索，最终确定以0.094M（0.7%）KCL溶液低渗处理2～3 min的最佳实验条件。获得了细胞膜完整、细胞质背景清楚、染色体分散良好的中期相。保证了染色体计数结果的准确性。应用该方法对6种被检物进行了检测，观察到CHL细胞染色体数目发生了明显的变化，染色体数目增加和减少的发生概率相近，而且所形成的非整倍体多为增加或减少1条染色体。

2.2 胞质分裂阻滞微核（CBMN）试验 纺锤体损伤诱发非整倍体的效应可用微核试验来验证。该技术方法的创新点在于使用了CBMN法：CHL培养物染毒的同时加入Cyt-B阻断胞质分裂，第一次分裂细胞均形成双核细胞，在分析时很容易识别，只计数双核细胞的微核率，提高了试验结果的准确性。CBMN试验结果表明6种被检物均诱导细胞微核率明显增加。

2.3 流式细胞术测量 染色体数目的变化必然使细胞内DNA含量改变。用流式细胞术测定每个细胞的DNA含量，给出细胞周期各期所占比例 （G0/G1）和DNA信号的分散度（CV），从分子水平检测到SP诱发非整倍体效应。

美、日、欧共体及我国现行的新药临床前致突变试验组合中，仍没有一项专门检测SP的试验。SP损伤纺锤体后会出现严重的遗传效应，使染色体丢失，造成子细胞染色体数目的改变，产生非整倍体，使基因产物不平衡，引发癌症等严重后果。建立有效的检测SP试验方法势在必行。

3 结 论

应用分化染色技术方法直接观察纺锤体形态损伤，虽然能检测出秋水仙碱、糖精、雌二醇、石棉、硝酸铅、偏二甲基肼的初始诱变作用，但这种实验技术方法复杂，难度也较大[7]。CBMN试验也获得阳性结果，流式细胞术虽然也能检出非整倍体的发生，但灵敏性不够高[8]。完整中期细胞染色体计数可以直观、准确地检查出它们诱发染色体数目异常。且该实验方法很简便，在一般实验室均可进行，因此笔者建议，将此方法推荐为筛检SP的试验方法。

[1]楼铁拄，王 琼，高沛永.偏二甲基肼诱发中国仓鼠肺细胞非整倍体[J].中国药理与毒理学杂志，1997，11(4):304.

[2]高沛永，王 琼，张学中，等.雌二醇诱发中国仓鼠肺细胞有丝分裂纺锤体损伤[J].中国药理与毒理学杂志，1994，8(4):301-304.

[3]王 琼 高沛永.偏二甲基肼诱发中国仓鼠肺细胞有丝分裂纺锤体损伤[J].中国药理与毒理学杂志，1998，12(3)：239-240.

[4]Cliet I.Fournier E.Melcion C.Cordier A.In vivo micronucleus test using mouse hepatocytes[J].Mntat Res,1989,216(6):321-326.

[5]Salassidis K,Bauchingerg M.Mitotic spindle damage induced by 3,4-dichloroaniline in V97 Chinese hamster cell examined by differential staining of the spindle apparatus and chromosomes[J].Mutagenesis,1990,5(4):367-370.

[6]高沛永.在致突变试验中应重视对纺锤体毒物的检测[J].遗传，1993，15(6):38-39.

[7]高沛永，王 琼.硝酸铅对CHL有丝分裂细胞纺锤体的损伤作用[J].卫生毒理杂志，1995，9(4):228-2230.

[8]高沛永，王 琼.秋水仙碱引起CHL细胞有丝分裂纺锤体损伤的观察[J].军事医学科学院院刊，1993，17(4):259-261.