豫南地区鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及药敏试验

刘纪成,吴海港,易先国,张广强,李 卫,李 洵,刘锦妮

(1.信阳农业高等专科学校,河南信阳 464000;2.西安天星生物药业股份有限公司,陕西西安 710075)

鸡大肠杆菌病是由致病性血清型的大肠杆菌引起的多种疾病的总称。在临床上可表现为脐炎、败血症、肉芽肿、全眼球炎、气囊炎、腹膜炎、输卵管炎等;还常常与病毒和其他细菌性疾病并发,造成鸡群的高死亡率,给养禽业造成严重经济损失。为了解豫南地区鸡肺脏中大肠杆菌的血清型及药敏性,以便有效地开展预防和治疗工作,我们进行了鸡肺脏大肠杆菌的分离、血清型鉴定及药敏试验,结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 病料 于2009年1～9月间,从豫南地区正阳、平舆、固始、淮滨等10个县的42家肉种鸡场、肉仔鸡饲养场、蛋种鸡场、蛋鸡场采取。

1.2 大肠杆菌标准血清 由中国兽医药品监察所提供。

1.3 供试动物 试验用小鼠由华中科技大学同济医学院提供,体重15～25 g,雏鸡购于湖北农业科学院SPF鸡场。

1.4 标准菌株 购于中国兽医药品监察所。

1.5 药敏试纸 购于杭州药物研究所。

1.6 病原菌的分离鉴定 无菌采取具有败血症、心包炎、肝周炎等病理变化的病死鸡心血、肝脏、脾脏,分别接种于普通肉汤、普通琼脂、血液琼脂和麦康凯琼脂,伊红美蓝琼脂培养基上,37℃培养24 h,挑选麦康凯琼脂平板上砖红色菌落接种普通琼脂斜面进行纯培养,培养后胶塞密封,置4℃冰箱保存备用,同时另挑选单个菌落涂片革兰染色,进行菌体形态和染色特征的观查。

1.7 生化鉴定 取M.C琼脂平板上粉红色单菌落接种于普通肉汤,于37℃培养18 h,按常规方法进行糖类发酵试验及生化反应[1]。

1.8 致死性试验 取体重15～25 g健康小鼠100只和10日龄雏鸡100只,分别随机分组,每组 4只,试验组小鼠腹腔接种24 h肉汤培养物0.2m L/只 ,试验组雏鸡肌肉注射24 h肉汤培养物0.4 m L/只,对照组分别用同样方法接种灭菌生理盐水。观察发病和死亡情况、剖检变化,并进行细菌分离。

1.9 血清型鉴定 经分离培养、形态特点和生化试验鉴定为大肠杆菌后,再用普通琼脂进行纯培养(37℃、18 h),然后用少量(5 m L/L)石炭酸生理盐水将菌苔洗下,制成浓稠菌悬液,经过121℃高压2 h,破坏其K抗原,冷却后取一铂金耳与血清(5～10倍稀释)在玻板上混匀,如0.5m in内出现明显凝集者为阳性反应,同时以菌悬液与生理盐水混合物作对照,观察有无自凝集现象[2]。

1.10 药敏试验 方法按药敏纸片说明书进行。

2 结果

2.1 细菌分离 在普通琼脂平板上长出表面光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形微凸起、中等大的菌落,在血液琼脂平板上长出菌落较大、边缘整齐、并有隆起的灰白色菌落,多数不溶血。在麦康凯琼脂平板上,形成中等大小的砖红色菌落,在伊红美蓝琼脂平板上,形成带有金属光泽的紫黑色小菌落。在肉汤培养基37℃培养24 h后,呈均匀混浊,管底有淡白色黏稠沉淀,管壁液面有菌环。

2.2 染色镜检 病料及培养物涂片染色镜检均可见两端纯圆、多数散在排列、革兰阴性短杆菌。

2.3 生化鉴定结果 34株致病性大肠杆菌的生化试验结果见表1,从表1可以看出各株均能在三糖铁培养基上产酸产气使培养基变黄,均不产生H 2 S。在发酵葡萄糖、V-P试验、M.R.试验、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验等常规生化试验结果完全符合大肠杆菌的生化特征,但在某些糖、醇的常规生化试验结果出现了一些差异。

2.4 致死试验结果 试验动物接种后连续观察8 d,小鼠试验结果是25株能全部致死小鼠,4株部分致死,5株不能致死。剖检死亡鼠,心外膜出血,肝肿胀、发黑或出血,雏鸡试验结果23株能全部致死雏鸡,5株部分致死,6株不能致死雏鸡,剖检死亡雏鸡,表现为纤维素性心包炎、心包积液,肝周炎、肝表面被一层薄膜状纤维素性渗出物覆盖,气囊炎。从死亡小鼠和雏鸡肝脏、腹水、脾脏回收菌的形态染色,生化特性与接种菌一致。

2.5 血清鉴定结果 从10个县市共分离34株大肠杆菌,除2株未能定性外,共出现10种血清型,结果见表2,从表2可以看出,鸡肺脏中分离的大肠杆菌以 O2、O78、O26、O22、O1为主,这 5 种血清型合计菌株26株,占定性菌株的81.25%。

表1 各菌株的生化鉴定结果

表2 32株致病性大肠杆菌的血清型

2.6 药敏试验 分离的大肠杆菌对强力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、培氟沙星高度敏感;对氧氟沙星、恩诺沙星、新霉素、氨苄青霉素中度敏感;对环丙沙星、利福平、氟哌酸、链霉素、红霉素、土霉素不敏感。结果见表3、表4。

表3 34株大肠杆菌对14种抗生素的判断标准 (%)

表4 34株大肠杆菌对14种抗生素的敏感结果

3 讨论

3.1 血清型鉴定结果表明,34株鸡致病性大肠杆菌的血清型比较复杂,不同来源的大肠杆菌血清型差异较大,同一来源的菌株O血清型也多不相同。对豫南地区10个县市42个鸡场中病鸡肺脏中分离的大肠杆菌血清型以 O2、O78、O26、O22 、O1 为主 ,这与文献报道有相同,也有差异,这可能与取样量较少或取样不具有代表性或血清型鉴定具有时间、环境特异性有关

3.2 采用参考美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)所推荐的纸片扩散方法(即Kirby-Bauer的菌液涂布法)进行。对从豫南地区分离出的34株致病性大肠杆菌所做的14种抗生素药敏试验,结果表明:大肠杆菌的特点是易形成耐药性,此次分离的大肠杆菌对强力霉素、氟苯尼考、丁胺卡那霉素、培氟沙星高度敏感;而对环丙沙星、利福平、氟哌酸、链霉素、红霉素、土霉素不敏感。结果还显示,分离到多数致病性菌株表现多种耐药性,在以上所分离的菌株中以三耐、四耐、五耐为主,分别有5、10株和 14株,耐药率分别为14.71%、29.41%和 38.24%,共占总分离菌株的82.36%。这些结果与刘吉山等[3]报道的安徽地区鸡致病性大肠杆菌耐药性以及李文刚等[4]报道河南省致病性大肠杆菌的多重耐药性基本一致。而本试验分离的大肠杆菌对环丙沙星、利福平、氟哌酸的耐药性较高,可以看出近几年大肠杆菌对氟喹诺酮的耐药性增高趋势明显。这种耐药性的出现可能与菌株长期处于环境中抗生素的选择性压力,及耐药基因通过染色体或耐药质粒在菌群间的广泛传播或扩散有关[5]。最近几年家禽养殖业迅猛发展,对疾病的预防和控制显得非常重要,尤其是在人们缺乏养殖业方面的知识,在饲料添加剂及治疗中常盲目使用抗菌药物,导致产生许多耐药性菌株。大肠杆菌的血清型繁多这也是产生耐药性的原因之一[6],在选择抗菌药物上建议考虑采取联合用药、交叉用药、轮换用药的方式,一方面可以充分发挥抗菌药物之间的协同作用,增加疗效;另一方面可以避免细菌长期与某一种药物接触,减少产生耐药性几率。由于大肠杆菌的血清型分布地区差异比较大、临床用药的差异等因素,使得各地区、各养殖场大肠杆菌的耐药谱差异很大[7]。因此,定期对分离菌株进行抗生素敏感性的监测,对有效防治养鸡场细菌性疾病有着重要的意义。

[1] 中国农业科学院哈尔滨病毒研究所.兽医微生物学[M].北京:中国农业出版社,1998:98-101.

[2] 夏业才,潘松年.禽大肠杆菌的研究一致病性大肠杆菌血清型鉴定[J].中国兽药杂志,1991,25(4):1-2.

[3] 刘吉山,沈志强,李峰.鸡大肠杆菌病病原鉴定及药敏试验[J].养禽与禽病防治,2000(2):190.

[4] 李文刚,杨治田,兰尊海,等.河南省猪致病性大肠杆菌菌株的鉴定[J].河南农业科学,2001,11(3):30-31.

[5] Prats G,Mirelis B,Llovet T.An tibiotic resistance trends in en teropathogenic bacterial isolated in 1985-1987 and 1995-1998 in Barcelona[J].Antim icrob Agen ts Chem other,2000,44:1140-1145.

[6] 许兰菊,张书松,潘学营.河南省部分地区鸡源致病性大肠杆菌生物特性的研究[J].中国家禽,2004,26(11):14-15.

[7] 刁有祥,李久芹,陈庆普.山东省鸡大肠杆菌的分离鉴定[J].中国预防兽医学报,2002,24(1):21-23.