家兔呼吸道疾病病原分离鉴定与药敏试验

袁定胜,王 斌,李旭廷,龚 雪

(四川省畜牧科学研究院,四川成都 610066)

随着家兔养殖的集约化和规模化,兔场呼吸道疾病呈增加趋势。笔者于2009～2010年走访了成都周边地区规模化兔场,发现该病具有普遍性,患病成年兔表现为流黏液性或脓性鼻涕,打喷嚏,剖检主要见肺实变、出血性肺炎、化脓性肺炎或纤维素性胸膜肺炎,成年兔耐受力强,一般不死亡,种兔不发情;患病幼兔表现为流黏液性鼻涕和打喷嚏,急性病例常突然死亡,剖检多见出血性肺炎。此病给养兔业带来了较大经济损失。为摸清兔呼吸道疾病的病原及防治方法,本试验采集鼻炎患兔的鼻腔拭子和病死兔的肺脏进行检测,查明病原体,并进行药敏试验,为疫病防治提供依据。

1 材料

1.1 样本采集 2009年8月至2010年3月从成都周边地区6个规模化兔场采集有呼吸道疾病症状家兔样本60份,其中42份为鼻腔拭子,18份为肺脏样本。

1.2 试剂、培养基和标准菌株 麦康凯琼脂(批号090312);普通肉汤琼脂(批号 090115);MH琼脂(批号090130);微量生化反应管(090808)和药敏纸片均购自杭州天和微生物试剂有限公司;兔鲜血琼脂平板为本实验室自制;标准菌株:大肠杆菌标准株(CVCC2801)、金黄色葡萄球菌标准株(CVCC1882),购自中国兽医药品监察所。所有培养基、玻璃器皿均灭菌后使用。

1.3 实验动物 昆明系小鼠,清洁级,购自四川大学华西实验动物中心。

2 试验方法

2.1 病料接种 肺脏病料在无菌条件下,切取病变和正常组织交界处的小组织块在培养基琼脂涂抹接种。鼻腔拭子直接涂抹于琼脂面边缘,然后以铂耳划线稀释接种。初次分离均接种鲜血琼脂平板,置37℃,24 h培养。

2.2 菌落观察及纯培养 观察菌落形态,是否有溶血,革兰染色镜检。革兰阳性菌接种血平板和普通营养琼脂平板,革兰阴性菌接种血平板和麦康凯琼脂平板。

2.3 生化试验 以菌落形态和染色特性做参考,进行针对性的生化试验。疑似葡萄球菌进行触酶试验和血浆凝固酶试验[1-2]。

2.4 致病性试验 将分离的病原菌调整浑浊度与0.5麦氏比浊管相当,分别腹腔注射小鼠,0.2m L/只,同时设置生理盐水空白对照,观察分离菌株的致病性。

2.5 药敏试验 根据CLSI推荐的K-B法检测分离菌的耐药性。用于接种巴氏杆菌的MH琼脂平板含10%兔鲜血。以大肠杆菌标准株和金黄色葡萄球菌标准株做对照,进行药敏质控。

3 结果与分析

3.1 分离培养结果 从42份鼻腔拭子中分离得细菌48株,其中革兰阳性球菌41株,阴性菌7株。18份肺脏病料中分离得细菌15株,其中革兰阳性球菌2株,革兰阴性菌13株。

3.2 形态描述和染色镜检结果 Ⅰ类菌10株,革兰阴性球杆菌,在鲜血琼脂平板上生长较快,针尖大小的菌落,透明或略带灰色,β溶血,麦康凯琼脂上呈菌落半圆隆起,光滑透明,土黄色,针尖大小,麦康凯平板颜色由红色变为黄褐色。Ⅱ类菌4株,革兰阴性球杆菌,鲜血琼脂上形成较小的菌落,不溶血,带有黏液性,灰白色、半透明至不透明,露珠状,麦康凯琼脂上不生长。Ⅲ类菌43株,革兰阳性球菌,在鲜血平板和营养琼脂平板上生长良好,在麦康凯平板上不生长。菌落为针头大小,呈圆形隆起,灰白或黄白色,部分菌落为金黄色,有β溶血和无溶血两种菌落。Ⅳ类菌6株,革兰阴性杆菌,在鲜血平板和普通琼脂平板上生长良好,在麦康凯平板上呈粉红色菌落。菌落为圆形、隆起、不透明。

3.3 生化鉴定结果 Ⅰ类菌不发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖,硝酸盐还原,尿素、氧化酶阳性,枸橼酸盐、硫化氢、吲哚、明胶液化阴性,判定为支气管败血波氏杆菌;Ⅱ类菌发酵葡萄糖和蔗糖,不发酵乳糖、木糖和七叶苷,硝酸盐还原,氧化酶、吲哚、鸟氨酸脱羧酶阳性,枸橼酸盐、硫化氢、尿素、明胶液化、M.R.、V-P阴性,判定为为多杀性巴氏杆菌;Ⅲ类菌中有35株触酶和凝固酶试验均阳性,判定为金黄色葡萄球菌,另外6株为凝固酶阴性葡萄球菌;Ⅳ类菌发酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖,硝酸盐还原、吲哚、鸟氨酸脱羧酶、枸橼酸盐利用、M.R.阳性,氧化酶、尿素、硫化氢、V-P阴性,判定为大肠杆菌。

3.4 致病性试验 接种多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和支气管败血波氏杆菌的小鼠24～72 h内全部死亡,接种金黄色葡萄球菌的小鼠48 h内出现精神沉郁等现象,部分死亡,接种凝固酶阴性葡萄球菌的小鼠未观察到明显异常。生理盐水对照组无死亡。死亡小鼠从肺脏、肝脏等器官中分离到同种菌。

3.5 药敏试验结果 37株金黄色葡萄球菌对复方新诺明的耐药最严重,耐药率达到80%,最敏感的为环丙沙星,敏感率达100%,分离菌对其余药物都存在不同程度的耐药。10株支气管败血波氏杆菌对头孢噻呋、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸钾、丁胺卡那霉素、庆大霉素、氟喹诺酮类敏感;对青霉素、阿莫西林、林可霉素耐药。4株巴氏杆菌对头孢噻呋、氟喹诺酮类、庆大霉素、丁胺卡拉霉素、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸钾敏感;对苯唑西林、青霉素、阿莫西林、卡拉霉素、克林霉素、阿奇霉素耐药。6株大肠杆菌对头孢噻呋、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉维酸钾敏感;丁胺卡那霉素、环丙沙星中度敏感;对青霉素、阿莫西林、苯唑西林、庆大霉素、卡那霉素、四环素、强力霉素、氟喹诺酮类和复方新诺明耐药,其中1株菌对亚胺培南耐药。药敏结果见表1。

表1 药敏试验结果

4 讨论

4.1 多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌、金黄色葡萄球菌和肠外致病性大肠杆菌是引起家兔呼吸道感染的主要病原菌[2]。笔者本次分离细菌与沙莎[3]等人1996年报道的川中南地区家兔呼吸道细菌分布基本一致。A juwape等[4]从108只临床健康兔的鼻腔内分离到108株金黄色葡萄球菌,分离率为100%,认为葡萄球菌属是家兔呼吸道常在菌。本次试验从发病家兔鼻腔中仅分离到2株支气管败血性波氏杆菌和1株大肠杆菌,在有肺脏病变的死亡兔肺脏分别分离到8株支气管败血性波氏杆菌和5株大肠杆菌,分离菌株对小鼠均有致病性。结合临床观察,鼻炎症状在各个日龄段均有发生,肺炎和死亡病例多在断奶前后发生。我们认为,引起成都周边兔场严重呼吸道感染的主要病原菌为支气管败血波氏杆菌和肠外致病性大肠杆菌,断奶仔兔感染后症状较重,以肺炎为主。多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌为上呼吸道感染病原菌,家兔感染后临床症状表现较轻微,以鼻炎症状为主。笔者将对分离菌株进行本动物回归试验,考察4种病原菌对家兔的致病性。

4.2 分离的细菌均有不同程度的耐药性。金黄色葡萄球菌显示出多重耐药,对β-内酰胺类、四环素类、庆大霉素和克林霉素耐药率在20%～50%,对复方新诺明的耐药率高达80%,支气管败血波氏杆菌对氨基糖苷类、氟喹诺酮类抗生素敏感;对β-内酰胺类、林可霉素耐药。多杀性巴氏杆菌对氟喹诺酮类敏感,与薛瑞辰[5]等人报道一致。本次分离的大肠杆菌菌株仅对头孢噻呋和β-内酰胺酶抑制剂复合制剂高度敏感;对四环素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类和青霉素类产生严重耐药性,部分菌株甚至对亚胺培南产生耐药性,其耐药机理待进一步研究。结合养殖场抗生素使用情况,我们分析以上养殖场较多使用了复方磺胺药物、青霉素等,导致磺胺类药物和青霉素耐药率偏高,兽医临床使用较少的头孢类和丁胺卡拉霉素耐药率较低,也间接说明兽用抗生素的不合理使用是临床耐药菌产生的一个重要原因。

4.3 规范的饲养管理和合理用药是防治兔呼吸道疾病关键。规模化兔场集约化程度高,饲养环境和疫病防控措施都影响到家兔的健康。对有呼吸道症状的家兔,应及时做病原分离、鉴定和药敏试验,针对性使用治疗药物。不合理使用抗生素将破坏家兔体内菌群平衡,导致耐药菌株的滋生。在实践中也可采用投喂(饮)清热抗菌的中药煎液,可以取得一定的防治效果。

[1] 布坎南R E,吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》翻译组,译.北京:科学出版社,1984:274-521.

[2] 汪洋,赵德明.一起兔支气管败血波氏杆菌病的诊治[J].中国畜牧兽医,2008(8):93.

[3] 沙莎,王琴,徐兴然,等.四川中南地区冬季家兔呼吸道细菌分布研究[J].中国养兔杂志,1999(5):16-17.

[4] A juw ape T P,A regbesola E A.The bacterial flora of the upper respiratory tract of normal rabbits[J].Israel J Vet Med,2002,57:121-123.

[5] 薛瑞辰,张富梅,张立永.氟喹诺酮类药物治疗兔巴氏杆菌病效果观察[J].中国兽医杂志,2005,41(10):3-34.