金属硫蛋白对应激猪血液和肌肉中非酯化脂肪酸及肌乳酸含量的影响

游思湘,李丽立,刘湘新,张 彬

(1.湖南农业大学动物科技学院,湖南 长沙 410128;2.中国科学院亚热带农业生态研究所,湖南长沙 410125;3.湖南农业大学动物医学院,湖南长沙 410128)

金属硫蛋白(metallothionein,MT)是一类广泛存在于生物体中的低分子量、富含金属和半胱氨酸且能被金属或其他因素诱导生成的金属结合蛋白。由于MT在微量元素储存、运输和代谢,重金属解毒;拮抗电离辐射;清除自由基以及机体生长、发育、生殖、衰老、肿瘤发生、免疫、应激反应等方面均具有重要的生物学作用[1-3],因此许多科研工作者对MT进行了广泛而深入的研究。这些研究主要集中在MT的理化性质、基因结构及其表达调控、生物学功能、与疾病的关系等方面[4-5]。但MT在应激状况下对机体哪些生理生化指标发生影响?这些影响对应激具有何作用?目前很少报道。本文探讨不同剂量MT对应激猪血清和肌肉中非酯化脂肪酸及肌乳酸的影响,初步了解MT在动物应激反应过程中的作用,以期为MT在畜牧业中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物 15日龄健康杜长大杂交乳猪18头,平均体重为4.8 kg。

1.2 仪器设备 AY-220电子天平(日本岛津制作所),UV-9100紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器有限公司)、离心机(上海沪西分析仪器厂),恒温水箱(长沙市清水塘医疗器械厂DHS-500)。

1.3 试剂 试验用MT为本实验室制备、分离、纯化[6]和定量[7]。其余试剂均为AR级。

1.4 分组及处理 将18头供试猪随机分为A、B、C 3组,每组6头。A组为对照组,不给MT;B组(低剂量试验组)和C组(高剂量试验组)分别肌肉注射MT 0.8 mg/kg体重剂量和1.6 mg/kg体重剂量;肌肉注射后驱赶运动25 min使乳猪产生应激。应激体征为:心跳 120次/min以上,呼吸 45次/min以上。

1.5 血样的采集 分别在肌肉注射MT 3 h和6 h后,每组随机抽取3头猪,采血,3 000 r/min离心20 min,分离血清,低温冷藏备用。

1.6 组织样品的采集 分别在肌肉注射MT 3 h和6 h后,每组随机抽取3头猪,屠宰取背最长肌5 g,供测定非酯化脂肪酸和乳酸。

1.7 组织样品处理 非酯化脂肪酸提取:取背最长肌2 g,用剪刀剪碎→研磨成肉糜→用氯仿萃取。

乳酸提取:取背最长肌2 g,用剪刀剪碎→加生理盐水研磨成肉糜→搅动20min,3 000 r/m in离心10 min,取上清,采用钨酸法沉淀蛋白质。

1.8 测定方法 非酯化脂肪酸测定采用一次提取比色法,乳酸测定采用分光光度计测定法。

1.9 数据处理 所有数据均以平均值±标准差表示,应用SPSS 13.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 驱赶应激3 h后,猪血清和肌肉中非酯化脂肪酸含量的变化 肌肉注射不同剂量金属硫蛋白并驱赶应激3 h后,猪血清和肌肉中非酯化脂肪酸含量的变化见表1。A组血清中非酯化脂肪酸的含量为118.51±8.52μmol/100 m L;B组和C组分别为159.14±5.17μmol/100 m L和 111.45±4.71 μmol/100m L,与A组相比,B组非酯化脂肪酸的含量明显增加,两者差异极显著(P＜0.01)。C组非酯化脂肪酸的含量与A组基本相同。A组肌肉中非酯化脂肪酸的含量为322.87±19.4μmol/100 g,B组和C组分别为405.30±17.71μm ol/100 g和396.54±15.14μmol/100 g,B、C两组与 A组比较差异极显著(P＜0.01)。

表1 肌肉注射不同剂量金属硫蛋白并驱赶应激3 h后猪血清和肌肉中的非酯化脂肪酸含量

2.2 驱赶应激6 h后,猪血清和肌肉中非酯化脂肪酸含量的变化 肌肉注射不同剂量金属硫蛋白并驱赶应激6 h后,猪血清和肌肉中非酯化脂肪酸含量的变化见表2。A组血清中非酯化脂肪酸的含量为178.71±16.45μmol/100 m L;B组和C组分别为94.43±14.11μmol/100 m L和 225.73±22.83μmol/100 m L,与A组相比,B组非酯化脂肪酸的含量明显降低,两者差异极显著(P＜0.01)。C组非酯化脂肪酸的含量与A组比较明显增加(P＜0.01)。A组肌肉中非酯化脂肪酸的含量为385.33±1.18μmo l/100 g;B组和C组分别为386.83±1.84μmol/100 g和 395.98±8.85μmol/100 g,B和C组非酯化脂肪酸的含量与A比较,基本上无差异。

表2 肌肉注射不同剂量金属硫蛋白并驱赶应激6 h后猪血清和肌肉中的非酯化脂肪酸含量

2.3 驱赶应激后,猪肌肉中乳酸含量的变化 肌肉注射不同剂量金属硫蛋白并驱赶应激3 h和6 h后,猪肌肉中乳酸含量的变化见表3。驱赶应激3 h后,A组肌肉中乳酸的含量为172.53±9.30 mg/100 g,B组为 163.07±2.72mg/100 g,C组为123.04±11.50m g/100 g,与A组比较,C组乳酸含量明显降低,两者差异极显著(P＜0.01);B组乳酸含量与A组无差异(P＞0.05)。驱赶应激6 h后,A组肌肉中乳酸的含量为193.39±5.19 mg/100 g,B组为 105.38±6.78mg/100 g,C组为139.47±14.17 mg/100 g,B组乳酸含量明显降低,C组变化不大,但总的说来,各试验组均低于对照组,而且差异极显著(P＜0.01)。

表3 肌肉注射不同剂量金属硫蛋白并驱赶应激3 h和6 h后猪肌肉中乳酸含量

3 分析与讨论

3.1 注射不同剂量MT对应激猪血清中非酯化脂肪酸(NEFA)的影响 已知血浆中非酯化脂肪酸的主要来源是脂肪的动员。因此,一般用血浆中脂肪酸的含量来衡量脂肪动员的程度[8]。在应激、饥饿或长时间运动等生理条件下,即当机体的能量消耗增强或糖的摄入不足时,脂肪组织中脂肪的动员就会加强,各组织首先是肌肉对它的利用加快。当组织摄入非酯化脂肪酸的速度加快时就会自动促进细胞对它的氧化。本试验结果表明,低剂量金属硫蛋白在应激初期,能够升高血清中的非酯化脂肪酸含量。随着应激时间的延长,高剂量试验组表现出显著升高血清中的非酯化脂肪酸含量的作用。据报道[9-10]:高FFA(游离脂肪酸或非酯化脂肪酸)可使胞质内长链脂肪酸辅酶A(1ihocholicacid.coenzymeA,LCA-CoA)水平升高,升高的LCA-CoA使丙二酰CoA对肉毒碱脂酰转移酶-Ⅰ(carnitinepalmitoy ltransferase-1,CPT-1)的抑制作用减弱,肝内FFA的氧化作用增强,糖异生酶活性升高,引起肝糖异生和肝糖原输出增加。在应激情况下,MT能够显著升高非酯化脂肪酸含量,增加非酯化脂肪酸的氧化,减少葡萄糖的消耗,进而引起肝脏糖异生作用增强及肝糖原分解加快,以满足应激状态下整个机体对能量的需要,因此,具有应激保护作用。

3.2 注射不同剂量MT对应激猪肌肉中非酯化脂肪酸含量的影响 已知非酯化脂肪酸可通过促进或抑制相应酶的基因表达来影响糖的代谢过程,如苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶以及干扰胰岛素的分泌。升高的非酯化脂肪酸使线粒体中的NADH/NAD+的比例升高,导致丙酮酸脱氢酶的活性下降或失活,进而使柠檬酸浓度升高,抑制糖分解过程中的关键酶-磷酸果糖激酶,使6-磷酸葡萄糖堆积,较高浓度的6-磷酸葡萄糖将抑制己糖激酶I,最终导致肌肉组织对糖的摄取与分解速度降低,以保证大脑、神经组织和红细胞等对葡萄糖有特殊需要的组织维持正常机能,有效地起到应激保护作用[11]。但随着运动时间的延长,血浆中非酯化脂肪酸含量虽然还是增加(高剂量组),但肌肉组织中非酯化脂肪酸含量则基本不变,说明此时肝脏加速了对非酯化脂肪酸的加工,大量非酯化脂肪酸在肝脏转变为酮体,使体内能量代谢发生改变,运动后期肌肉组织通过摄入大量酮体来补充能量的需要。酮体是运动晚期的重要能源物质[12]。

3.3 注射不同剂量MT对应激猪肌肉中乳酸含量的影响 糖的分解供能过程中,无论是有氧氧化还是糖酵解过程,都要经过将葡萄糖转变成丙酮酸的系列反应,然后,沿着不同的途径进行代谢。故随着运动强度的增大,需能量增加,肌肉中丙酮酸含量显著升高。如果丙酮酸的生成速率超过线粒体的代谢能力,大量的丙酮酸必然由乳酸脱氢酶催化转化成为乳酸[13]。但近年研究发现运动过程中,线粒体并不缺氧,同时,大量的研究发现,通过服用二氯乙酸盐。提高丙酮酸脱氢酶的活性可明显降低乳酸的生成,故认为在正常大气中进行大强度运动时肌肉中乳酸的生成,可能是由于丙酮酸的生成量大于线粒体的氧化磷酸化能力,使过多的丙酮酸在乳酸脱氢酶作用下生成乳酸,而不能简单认为是由于机体的缺氧造成的[13-14]。NADH升高引起细胞内氧化还原状态改变,可刺激乳酸生成;NADH/NAD比值升高有利于丙酮酸脱氢酶从有活性状态向无活性状态转变,从而降低了氧化磷酸化作用[14]。

试验结果表明:在驱赶应激6 h后,试验组和对照组虽然都是完成相同运动负荷,但试验组肌肉中乳酸含量低得多,说明MT具有增强线粒体的氧化磷酸化作用,提高机体的有氧代谢和运动耐力,因此能够缓解疲劳程度,提高应激能力。

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