早期气导听觉剥夺对幼鼠听觉发育的影响△

王枫 王方圆 黑任轶 刘顺利 米文娟 陈阳 邱建华

动物出生后神经系统的发育与环境密切相关，研究表明，早期声环境的改变，可对大鼠听觉的发育产生重要影响[1,2]。改变嗅觉、视觉和听觉系统中感觉输入信号会影响相应系统神经网络在形态和功能上的发育与成熟[3～5]。听觉剥夺效应是1996 年由15位著名听力学家组成的Eriksholm工作组讨论提出，并定义为由于声学信息的减少导致的听觉功能逐渐下降[6]。本研究旨在观察大鼠听觉发育早期气导听觉剥夺对Corti器发育及听力的影响。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 实验动物采用清洁级SD乳鼠60只，雌雄不拘，由第四军医大学动物实验中心提供，随机分为对照组和听觉剥夺组，每组30只。听觉剥夺组于出生后12天行双外耳道填塞，饲养于密闭隔声室，42天时去除填塞物，开放外耳道在正常声音环境饲养；对照组动物在正常食水、正常声音环境饲养。

1.2外耳道堵塞方法 SD仔鼠生后12天时行外耳道填塞，选取助听器耳模材料，适量大小，塑形后待其半凝固，沿外耳道方向置入耳道口，有机粘合剂固定。每天观察耳道，填塞物如有脱落，立即补填。动物较大时则以2%戊巴比妥钠(100 mg/kg)行腹腔注射麻醉后填塞耳道，并以手术缝线缝合外耳道口，以免抓脱。

1.3听性脑干反应检测 分别于出生后21、28、35、42、56 d采用听觉电生理检测仪(Biologic，Traveler Express E，USA)对两组大鼠行ABR检测。

实验动物以2%戊巴比妥钠(100 mg/kg)行腹腔注射麻醉。听觉剥夺组取出耳道填塞物后进行检测。记录电极刺入矢状缝与两外耳道连线交点头皮下，参考电极放置在刺激耳后皮下，接地电极放置在大鼠尾根部皮下。交替短声刺激，声源距外耳孔1.0 cm，刺激间隔为0.1 ms，滤波带通为100～2 000 Hz，扫描时间为10 ms，叠加次数512次。以刚刚出现可以辨认的波Ⅱ或波Ⅲ为标准记录ABR反应阈。

1.4扫描电镜标本制备 对照组和听觉剥夺组分别于出生后42、56天各随机抽取3只大鼠，行扫描电镜标本制备：动物先行戊巴比妥钠腹腔麻醉，4%多聚甲醛、1.5%戊二醛混合液灌注固定，取耳蜗在解剖显微镜下剥去骨壳，去除螺旋韧带，撕去盖膜，显露基底膜，立即放入3%戊二醛(pH 7.2)中固定2 h，1%锇酸后固定1 h，梯度丙酮脱水后用梯度醋酸异戊酯置换，临界点干燥仪干燥，离子溅射仪喷金镀膜，扫描电镜下观察。

1.5统计学方法 ABR检测结果采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析(One way ANOVA)。

2 结果

2.1ABR检测结果 对照组大鼠听性脑干反应阈值随年龄增长呈下降趋势，35、42、56天时ABR阈值均较21天时显著下降(P<0.01)，56天时ABR阈值基本达到正常成年大鼠水平。

听觉剥夺组大鼠35天时听性脑干反应阈值显著增高，42天时仍较对照组显著增高(P<0.01)。42天后开放外耳道恢复气导声音刺激，至56天时听性脑干反应阈值仍较对照组显著增高(P<0.01)。随年龄增长听觉剥夺组听性脑干反应阈值下降趋势消失，35、42、56天的反应阈比较差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

2.2扫描电镜结果 对照组大鼠耳蜗基底膜扫描电镜观察显示外毛细胞纤毛排列整齐，无毛细胞缺失及纤毛排列紊乱(图1A)。听觉剥夺组42天时可见基底膜各类细胞表面均产生大量细小囊泡样改变，外毛细胞纤毛末端膨大，大部分融合(图1B)，56天时基底膜表面改变与42 d时类似，但程度稍轻(图1C)。

表1 两组大鼠出生后不同时间听性脑干反应阈值

注：*与对照组21天时比较，P<0.01；# 与对照组同天龄比较，P<0.01

图1 各组动物外毛细胞纤毛扫描电镜结果

3 讨论

大鼠生后听力发育的“关键期”一般认为从第12天开始，到第30天结束[7, 8]。众多研究表明，早期声音信号刺激可诱导听觉神经中枢的发育和成熟，听觉剥夺则具有延缓大鼠上外橄榄核(lateral superior nucleus，LSO)神经元抑制性突触发育的作用[9, 10]。Sanes等[11]研究报道，破坏出生后一周大鼠的耳蜗则可阻断与抑制性突触相关的轴索和树突正常形态学再变构的过程。同样，破坏幼年沙鼠耳蜗阻断声输入也具有阻断LSO神经元抑制性突触和树突的形态发育的作用[12]。然而早期气导听觉剥夺对Corti器发育的影响尚不清楚。

本研究在大鼠出生后12～42天听觉发育早期对其进行气导听觉剥夺，观察气导听觉剥夺对大鼠Corti器发育及听力的影响，结果可见大鼠早期听觉刺激在听觉发育和成熟过程中起着关键的作用，正常对照组大鼠听觉发育随年龄增长逐渐成熟，听性脑干反应阈值随年龄增长逐步下降，56天时基本达到正常成年大鼠水平。早期气导听觉剥夺组大鼠35天时听觉发育明显受损，听性脑干反应阈值显著增高，42天时开放外耳道恢复气导声音刺激后，至56天时听力无明显改善。扫描电镜可观察到早期听觉剥夺后大鼠耳蜗基底膜多种细胞表面产生大量细小囊泡样改变以及外毛细胞损伤，可见人为减少听觉发育关键期声音信号的传入，可影响Corti器毛细胞的发育，听觉发育关键期过后，再给予正常声音刺激已经不能逆转这种影响。文中结果说明气导声音刺激在大鼠听觉感受器发育过程中起着十分重要的作用。

本研究通过听觉电生理、扫描电镜等方法证实气导声音信号刺激在Corti器发育过程中具有重要的促进作用，为临床听觉发育异常疾病的诊断、治疗和预防提供一定的理论基础。气导声音信号促进Corti器正常发育的分子机制有待于进一步研究。

4 参考文献

1 Bures Z, Grécová J, Popelár J,et al. Noise exposure during early development impairs the processing of sound intensity in adult rats[J]. Eur J Neurosci,2010,32:155.

2 Leibovici M, Safieddine S, Petit C. Mouse models for human hereditary deafness[J]. Curr Top Dev Biol,2008,84:385.

3 Rochefort C, Gheusi G, Vincent JD, et al. Enriched odor exposure increases the number of newborn neurons in the adult olfactory bulb and improves odor memory[J]. J Neurosci,2002,22:2 679.

4 Rittenhouse CD, Shouval HZ, Paradiso MA, et al. Monocular deprivation induces homo synaptic long-term depression in visual cortex [J]. Nature, 1999, 397:347.

5 Di Cristo G, Berardi N, Cancedda L, et al. Requirement of ERK activation for visual cortical plasticity [J]. Science, 2001, 292:2337.

6 Arlinger S, Gatehouse S, Bentler RA, et al. Report of the eriksholm workshop on auditory deprivation and acclimation[J]. Ear Hear,1996,17:87.

7 Games KD，Winer JA. Layer V in the rat auditory cortex：projections to the inferior colliculus and cintralateral cortex[J]．Hear Res,1988,34:1.

8 Nakahara H, Zhang LI, Merzenich MM.Specialization of primary auditory cortex processing by sound exposure in the “critical period”[J]. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101:7 170.

9 Webster DB, Webster M. Effects of neonatal conductive hea-ring loss on brain stem auditory nuclei[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol,1979,88:684.

10 Hassfurth B, Magnusson AK, Grothe B, et al. Sensory deprivation regulates the development of the hyperpolarization-activated current in auditory brainstem neurons[J]. Eur J Neurosci,2009,30:1 227.

11 Sanes DH, Markowitz S, Bernstein J, et al. The influence of inhibitory afferents on the development of postsynaptic dendritic arbors[J]. J Comp Neurol, 1992, 321:637.

12 Kakazu Y, Akaike N, Komiyama S, et al. Regulation of intracellular chloride by cotransporters in developing lateral superior olive neurons[J]. J Neurosci, 1999,19:2 843.