环介导恒温扩增方法快速检测乳中单增李斯特菌

蒋亚男，满朝新，赵凤，刘颖，薛玉清，胡惠秩，李博，姜毓君,

（1.东北农业大学，哈尔滨 150030；2.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨 150086）

环介导恒温扩增方法快速检测乳中单增李斯特菌

蒋亚男1，满朝新2，赵凤1，刘颖1，薛玉清1，胡惠秩1，李博1，姜毓君1,2

（1.东北农业大学，哈尔滨 150030；2.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨 150086）

建立了一种快速检测灭菌乳中单增李斯特菌的环介导恒温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)方法。以hlyA基因作为靶基因，对人工污染乳中单增李斯特菌进行了LAMP方法的灵敏度试验，同时与PCR方法进行比较。并对单增李斯特菌和7种其他乳中常见致病菌进行了LAMP检测，以验证该方法的特异性。结果表明，LAMP检测单增李斯特菌的特异性强，检出限为42 mL-1，其灵敏度比普通PCR高10倍。并且检测时间比PCR更短，在1.5 h内即可完成扩增反应。此方法快速、特异、简单、灵敏，具有较高的推广价值。关键词：环介导恒温扩增；单增李斯特菌；牛乳

0 引言

单核细胞增多性李斯特菌（Listeria monocytogenes,以下简称单增李斯特菌）是重要的食源性致病菌，也是我国乳及乳制品中致病菌检测指标之一[1]。随着乳及乳制品安全问题被各界广泛关注，致病菌的快速检验和有效鉴定对乳品的质量和安全有着重要意义[2]。

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP），是2000年Notomi T等人研发的，一种不需要变温复制、高效，快速的的核酸扩增新方法[3.4]。本研究拟建立一种检测乳中单增李斯特菌的LAMP方法，特异性的扩增该菌的毒力基因hlyA，达到快速检测乳及乳制品中的单增李斯特菌的目的。

1 实验

1.1 材料与仪器

单增李斯特菌CMCC54006，铜绿假单胞杆菌ATCC27853，金黄色葡萄球菌ATCC13565，沙门氏菌ATCC14028，英诺克李斯特ATCC33090，蜡样芽胞杆菌CMCC63303，福氏志贺氏菌CMCC51572，大肠杆菌O157:H7（实验室保存），细菌基因组DNA提取试剂盒，甜菜碱（Betaine），9700型PCR仪，UVP凝胶成像系统，灭菌乳。

1.2 方法

1.2.1 DNA模板的制备

单增李斯特菌和英诺克李斯特菌用胰酪胨大豆酵母浸膏肉汤（TSB-YE）培养基、其他实验菌株用营养肉汤（NB）培养基37℃并200 r/min摇床培养12 h，然后用细菌基因组DNA提取试剂盒制备DNA模板，-20℃保存备用。

1.2.2引物设计与合成

在单增李斯特菌中，由hlyA基因编码的李氏溶血素（ListeriolysinO，LLO），是单增李斯特菌最主要的致病因子。本研究针对hlyA基因来设计LAMP引物（见表1），序列由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

1.2.3 LAMP方法的建立

将1ml单增李斯特菌液标准菌株（CMCC54006）的菌液，用试剂盒提取DNA后，按如下体系和反应条件进行LAMP反应。体系为模板DNA 2 μL，J-FIP和JBIP各1.6 mmol，J-F3和J-B3各0.2 mmol，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.6 mmol，Mg2+（25 mmol）4 uL，Betaine 1mol，Bst酶8 U，灭菌的去离子水补至25 μl。反应条件：95℃，5 min，迅速冷却加入酶，63℃，60 min，80℃，2 min反应结束。

1.2.4 LAMP方法的特异性

对单增李斯特菌CMCC54006和7种其他乳中常见的肠道致病菌：铜绿假单胞杆菌ATCC13565，金黄色葡萄球菌ATCC13565，沙门氏菌ATCC14028，英诺克李斯特ATCC33090，蜡样芽胞杆菌CMCC63303，福氏志贺氏菌CMCC51572，大肠杆菌O157:H7进行培养后，提取其DNA，然后按1.2.3的LAMP反应条件和体系，进行LAMP反应。

1.2.5 LAMP方法检测灭菌乳的灵敏度

以10倍梯度稀释的单增李斯特菌对经检验不含单增李斯特菌的灭菌乳进行污染，使最终灭菌乳中单增李斯特菌浓度为4.2×108～4.2 mL-1。取1 mL该人工污染的灭菌乳，加入质量浓度为250 g/L的柠檬酸钠150 μL和1 mol/L的氢氧化钠100 μL，10 000 r／min离心2 min，弃上清；用同体积生理盐水洗涤沉淀，再10 000 r／min离心1 min[7]。然后用提取细菌DNA做为模板，进行LAMP反应。

1.2.6 PCR方法检测灭菌乳的灵敏度

为了与LAMP检测灭菌乳中单增李斯特活菌的灵敏度相比较，以1.2.4中DNA为模板进行PCR反应。其引物为：J-F3和J-B3（见表1）。25 μL反应体系：10× PCR Buffer2.5 μL，引物F3和B3各1 μL(10 mmol/L)，2 μL dNTPs(每dNTP 2.5 mmol/L)，0.5 μL(5 U/μL) rTaq DNA聚合酶，2 μL模板,加灭菌的去离子水至25 μL。反应条件为94℃（3 min）预变性：94℃（30 s），58℃（45 s），72℃（45 s）进行30个循环；最后72℃延伸6 min。

2 结果

2.1 LAMP方法的建立

为了验证在本研究所建立的LAMP体系和反应条件下以及本研究所设计的LAMP引物与单增李斯特菌hlyA基因是否匹配、能否有效的扩增出LAMP特异性条带，按1.2.3所述方法进行反应，结果如图1所示。

表1 LAMP引物序列[5]

图1中，M为DNA marker（下同）；1为阴性对照（下同）；2为单增李斯特菌CMCC54006。

由图1可以看出，1号泳道没有条带，而2号泳道出现了由大小不同片段组成的阶梯式图谱，条带清晰，与理论的LAMP特异性条带一致，说明了本研究所建立的检测单增李斯特菌的LAMP方法可行。

2.2 LAMP方法的特异性分析

以单增李斯特菌和7种其他乳中常见致病菌的DNA来检验本研究所建立的LAMP反应的特异性，扩增产物经2%琼脂糖电泳后,结果如图2所示。

图2中，2～9分别为单增李斯特菌CMCC54006，英诺克李斯特菌ATCC33090，铜绿

假单胞杆菌ATCC13565，沙门氏菌ATCC14028，金黄色葡萄球菌ATCC13565，大肠杆菌O157:H7，蜡样芽胞杆菌CMCC63303，福氏志贺氏菌CMCC51572。由图2可以看出，只有泳道2有LAMP特异性条带，其他泳道都没有LAMP特异性条带产生，说明了本研究建立的LAMP方法只针对单增李斯特菌的靶基因进行扩增，而未对其他几种常见致病菌的基因产生扩增。

2.3 LAMP检测灭菌乳的灵敏度分析

为了模拟实际受检样品，人工添加单增李斯特菌于灭菌乳中，使灭菌乳中菌浓度分别为4.2×108～4.2 mL-1，然后用试剂盒提取DNA作为模板，进行LAMP反应，结果如图3所示。

图3中，2～10为灭菌乳中单增李斯特菌浓度分别为4.2×108，4.2×107，4.2×106，4.2× 105，4.2×104，4.2×103，4.2×102，42，4.2 mL-1。由图3可以看出，泳道2～8有LAMP特异性条带，而泳道10结果为阴性，表明LAMP检测灭菌乳中单增李斯特菌的检出限为42 mL-1。

2.4 PCR检测灭菌乳的灵敏度分析

为了与LAMP检测灭菌乳中单增李斯特活菌的灵敏度相比较，以1.2.4中DNA为模板进行PCR反应，结果如图4所示。

图4中，2～10为灭菌乳中单增李斯特菌浓度分别为4.2×108，4.2×107，4.2×106，4.2×105，4.2×104，4.2×103，4.2× 102，42，4.2 mL-1。由图4可以看出，泳道2～8有LAMP特异性条带，而泳道9和10结果为阴性，表明PCR检测灭菌乳中单增李斯特菌的检出限为4.2×102mL-1。

3 讨论

乳及乳制品中致病菌的检测方法很多，但目前，企业和质检部门还是采用传统的检测方法（标准平板计数法和显微镜直接观察法），检测的周期长而且操作繁琐。而随着分子生物学的发展，PCR方法、Real-Time PCR已广泛应用与乳及乳制品中致病菌的检测中[6-8]，但其需要特殊的仪器才能完成反应，而且反应时间相对较长等缺点，都制约其技术的进一步发展。LAMP技术是针对目的基因设计4条引物（或6条），在具有链置换的Bst酶作用下，进行恒温扩增，不需核酸的变温复制过程，所以不仅缩短了反应时间，同时进行高效扩增，而且不需要利用复杂的仪器就能完成操作。

所以找到一些新检测方法，是科研工作者们孜孜追求的目标。而LAMP技术作为一种的极有应用前景的检测技术之一，已经在检测食源性致病菌中得到了应用[9,10]。本研究建立的检测灭菌乳中单增李斯特菌的LAMP方法，是通过琼脂糖电泳检测来观察LAMP扩增产物。目前除此方法外，还可以向LAMP反应液中加入SYBR Green I，通过紫外灯或日光下肉眼进行扩增结果判定，如果有扩增产物产生，反应混合物变绿色；反之，则保持橙色不变。此外还可通过观察焦磷酸镁（副产物之一）的浊度来检测，并使用浊度仪来进行了定量。

然而，DNA水平的LAMP检测技术也存在缺点，比如LAMP方法检测食品中食源性致病菌，既对活菌DNA进行扩增，同时也能扩增死菌DNA,故而会过高的评估样品中实际存在细菌量。因此如何改进以便能有效区分死/活细菌，是LAMP技术在实际检测食源性致病菌工作的发展趋势。

4 结论

本研究以hlyA为靶基因，建立起检测灭菌乳中单增李斯特菌的LAMP方法。研究表明该方法特异性强、灵敏度高，检出限为42 mL-1，比普通PCR方法高10倍，而且检测周期短，仅需约1.5 h即可完成检测。该检测方法效率高、操作简单、成本低廉，可以广泛地应用到基层单位乳及乳制品检测中，具有极大地推广价值。

[1]严剑波,王虹玲,朱水荣,等.单增李斯特菌LAMP方法的建立[J].中国卫生检验杂志,2009,19(9):2048-2050.

[2]张守文,尹蕾,周玉玲,乳品中有害微生物的检测技术和发展方向[J].中国乳品工业,2010,38（1）:35-38.

[3]NOTOMI T,OKAYAMA H,MASUBUCHI H,et al.Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research,2000,28 (12):63.

[4]MORI Y,NAGAMINE K,TOMITA N,et al.Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplification Reaction by Turbidity Derived from Magnesium Pyrophosphate Formation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2001,289(1):150-154.

[5]袁耀武,张亚爽,马晓燕,等.LAMP检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究[J].中国食品学报,2009,9(3):169-173.

[6]周微,张伟钦,付宇,贡汉生,等.荧光定量PCR方法快速检测原料乳中的大肠杆菌[J].中国乳品工业,2009,37(11):39-42.

[7]杨洋,张伟,袁耀武,等.PCR检测乳品中金黄色葡萄球菌[J].中国农业科学2006,39(5):990-996.

[8]李一松,王明娜,吕琦,等.SYBR Green I荧光定量PCR检测乳中携带sea基因金黄色葡萄球菌的研究[J].食品科学,2008,29(7):235-239.

[9]朱胜梅,吴佳佳,徐驰,等.环介导等温扩增技术快速检测沙门菌[J].现代食品科技2008,24(7):725-730.

[10]胡连霞,张伟,张先舟,等.改良环介导等温扩增技术快速检测婴儿配方奶粉中的阪崎肠杆菌[J].微生物学报2009,49(3):378-382.

Rapid detection of Listeria monocytogenes by LAMP technology in sterilized milk

JIANG Ya-nan1,MAN Chao-xin2,ZHAO Feng1,LIU Ying1,XUE Yu-qing1, HU Hui-zhi1,LI Bo1,JIANG Yu-jun1，2
1、Northeast Agricultural University College of Food Science,Haerbin 150030,China；2、National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Harbin 150086,China)

An assay using Loop-mediated isothermal amplification(LAMP）technology was developed for directly rapid detection of Listeria monocytogenes in sterilized milk.We chosed the gene hlyA of L.monocytogenes as target gene and amplified the gene by LAMP in sterilized milk,The sensitivity of LAMP was compared with the PCR method,Listeria monocytogenes and seven other intestinal bacterias were detected for specificity by LAMP.The specificity of LAMP was higher,The detection sensitivity of Listeria monocytogenes in sterilized milk was 42 mL-1by LAMP,It’s sensitivity was 10 times than the PCR method,Only 1.5 h was expent to finish the whole test.So the method was rapid,specific,simple,and with high value of promotion.

Loop-mediated isothermal amplification;Listeria monocytogenes;milk

TS252.7

A

1001-2230（2011）04-0045-03

2011-01-15

国家科技支撑计划项目（2009BADB9B06）。

蒋亚男（1985-），女，硕士研究生，食品微生物与生物技术。

姜毓君