超高效液相色谱——三重四级杆质谱测定乳与乳制品中氯霉素的残留

巩军,褚中秋,姜金斗,周红

(1.农业部乳品质量监督检验测试中心，哈尔滨 150090；2.国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨 150086）

超高效液相色谱
——三重四级杆质谱测定乳与乳制品中氯霉素的残留

巩军1,褚中秋1,姜金斗1,周红2

(1.农业部乳品质量监督检验测试中心，哈尔滨 150090；2.国家乳制品质量监督检验中心，哈尔滨 150086）

建立了乳与乳制品中氯霉素残留的超高效液相色谱——三重四级杆测定方法。该方法采用电喷雾电离源、多重反应监测负离子模式，可对氯霉素残留进行定性和定量测定。该方法的检出限为牛奶0.05 μg/kg，乳粉为0.1 μg/kg，线性范围在0.4～30.0 μg/L内的回归方程为y=798.97+1874.56x，r=0.9993，加标回收率75.0%～94.6%，相对标准偏差为4.2%～12.8%。该法具有样品处理简单方便，灵敏度高，分析时间短等优点，可以满足乳与乳制品中氯霉素残留的测定。

超高效液质联用仪；氯霉素；残留

0 引言

氯霉素是一种广谱抗生素，在奶牛上属禁用的抗生素。但因其价格低廉、治疗效果好等而使个别地区、个别奶农违规使用[1]，从而造成了生乳及相关产品中氯霉素的残留的存在，给消费者的健康带来潜在的危害。2011～2012年度农业部及质检总局也将氯霉素等抗生素纳入到生乳与乳制品风险监测中，并在个别地区检出氯霉素残留。目前检测氯霉素残留的方法主要包括：酶联免疫法、液相色谱法、气相色谱法、液-质联用法和气-质联用法等[2-5]，同时也制定了测定动物源性食品中氯霉素测定的国家标准、行业标准[6-7]，但在适用范围中都未涵盖乳及乳制品，处理方法也不适用于该类产品。为此，我们根据乳与乳制品的特性，为能准确定性定量测定痕量氯霉素残留，基于超高效液相色谱仪快速、高效分离的特点，结合三重四极杆质谱高灵敏的的定性定量功能，建立了适于乳与乳制品中痕量氯霉素残留测定的、具有操作简单、灵敏度高、测定时间短等优点的UPLC-MS-MS方法。

1 材料与方法

1.1 试剂

用于流动相的乙腈为色谱纯试剂；用于样品处理的乙腈、正己烷、乙酸乙酯、高氯酸均为分析纯试剂；氯霉素标准品(纯度大于99.5%)。

1.2 仪器

Waters AcQuity超高效液相色谱、Waters Xevo TQ MS质谱仪。

1.3 色谱条件

色谱柱：Waters BEH-C18柱(1.7 μm，2.1 mm×100 mm)；柱温为30℃；样品室温度为10℃；流速为0.35 mL/min；进样量为5 μL；流动相为乙腈+水，洗脱梯度如表1所示。

表1 梯度洗脱条件

1.4 质谱条件

离子化模式为ESI―；毛细管电压为2.20 kV；锥孔电压为30 V；脱溶剂气温度为450℃；脱溶剂气流速为800 L/h；锥孔气流速为20 L/h；源温度为150℃。

1.5 样品处理

1.5.1 牛奶

称取5 g(精确至0.1 mg)至30 mL离心管中，加入5 mL乙腈充分混匀，超声提取10 min，以5 000 r/min离心10 min，将上清液转入另一30 mL离心管中；再加入5 mL乙腈至残渣中漩涡混匀，重复提取一次，合并上清液，用乙腈定容至15 mL，混匀；加入5 mL乙腈饱和正己烷，涡旋混匀1 min，静置分层，弃去正己烷层。再加入5 mL饱和正己烷，重复上述步骤。将乙腈层全部转移至旋转蒸发瓶中，50℃真空旋转蒸发近干，用50%乙腈淋洗蒸发瓶，定容至1 mL，用0.45 μm滤膜过滤，进样10 μL进行测定。

1.5.2 乳粉

称取1 g(精确至0.1 mg)乳粉至30 mL离心管中，加入3 mL 40℃水充分溶解，涡旋混匀1 min，加入5 mL乙腈充分混匀，超声提取10 min，其余步骤同1.5.1。

2 结果与分析

2.1 样品处理的优化

牛奶及乳粉特别是配方乳粉中成分复杂，蛋白质含量较高，氯霉素属于弱极性化合物，在水中溶解性较差，易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂。据此我们采用乙腈直接萃取后，用乙腈饱和的正己烷进行脱脂净化。净化后的乙腈溶液采用真空浓缩的方式蒸干后用50%乙腈溶液溶解残渣进行测定。利用超高效液相分离速度快、分离度高的优势无需再进行固相萃取净化就可直接上机测定。经试验对比：采用文献报道的5%高氯酸沉淀蛋白质处理后直接上机测定的方法[8]，发现由于样液酸性及本地干扰过大等不利于分离测定；采用乙酸乙酯提取对部分乳制品样品而言由于极易产生乳化现象，即使加入氯化钠也难以分层，致使样品处理困难，提取效率低；而采用固相萃取既耗时、成本又高。本实验中采用的方法经加标回收等实验证实具有较高的稳定性和满意的提取效率。

2.2 质谱条件的优化

利用仪器本身自动优化的功能，采用200 ng/mL的氯霉素标准溶液以流动注射的方式在负离子模式下进行锥孔电压、碰撞电压等质谱条件的优化并对母离子进行全扫描，确定氯霉素的分子离子为m/z 321。然后以上述离子为母离子，对其子离子进行全扫描，在已优化的质谱测定条件下主要子离子m/z为152.1、257.1。据此我们确定定性离子采用m/z321/152.1、321/ 257.1；定量离子采用m/z 321/152.1。这与有关标准及文献中提供的定性、定量离子（320.9/151.9、320.9/ 256.9）基本一致[6、8]。

2.3 色谱条件的优化

由于氯霉素属于弱极性化合物，在水中溶解性较差，易溶于甲醇、乙腈等有机溶剂。本方法直接采用水-乙腈为流动相，利用梯度洗脱（见表1）的方法缩短分离时间，提高分离效果。有关文献及标准中的流动相一般要配以5～10 mmol/L乙酸胺溶液以提高分离度[6，8]。但对于超高效液相而言，由于流量小、流速低、压力大、管线细等特点应尽量不采用含盐的流动相等，以利于防止管路堵塞；特别是利于质谱测定，减小锥孔等污染。利用仪器分离效率高的优势只采用水-乙腈作为流动相就可达到满意的分离效果，且整个测定过程仅需5 min即可全部完成，如图1所示。

2.4 线性范围与检出限

将逐级稀释的标准工作液分别进样10 μL，以定量离子测定结果进行线性回归计算，线性范围为0.4～30 μg/L，回归方程y=798.97+1874.56x(y为峰面积；x为质量浓度，μg/L)，相关系数r=0.9993。以不含氯霉素的灭菌乳、全脂奶粉作为本底3倍噪音计算出的最低检出限分别为0.05 μg/kg、0.1 μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

分别选取灭菌乳与全脂乳粉，按1.5称取样品至30 mL离心管中，分别添加氯霉素标准溶液后进行样品处理。每个质量分数同时添加6个样品进行精密度测定，检测质量分数为6个平行样品的平均值。回收率与精密度测定结果如表2所示。

3 结论

表2 样品中氯霉素的回收率与相对标准偏差

（1）建立了乳与乳制品中氯霉素残留的超高效液相色谱——三重四级杆质谱联用测定方法。该法样品操作简单、成本低、测定周期短、灵敏度高等优点。

（2）通过对样品处理方法的优化，弥补了相关标准中对乳与乳制品类样品处理方法的缺失。且该处理方法即可减小本底干扰，提高回收率，又可明显提高测定的灵敏度。最低检出限牛奶为0.05 μg/kg、奶粉为0.1 μg/kg。

（3）该方法线性范围较宽，在0.4～30 μg/L的范围内呈良好的线性关系。回归方程为y= 798.97+1874.56x，相关系数r=0.9993。

（4）样品加标回收率在75.0%～94.6%，相对标准偏差为4.2%～12.8%。完全能满足痕量成分定量测定的要求。

[1]中华人民共和国公告第235号，附录4：禁止使用的药物，在动物性食品中不得检出.

[2]农业部1025号公告-26-2008动物源食品中氯霉素残留检测酶联免疫吸附法.

[3]潘莹宇，许茜，康学军，等.高效液相色谱荧光检测法测定牛奶中氯霉素的残留量[J].色谱，2005（11）：577-580.

[4]彭莉,程江,高岚等.牛奶中氯霉素残留的气相色谱测定法研究[J].中国兽药杂，2006(9):14-17.

[5]李鹏，邱月明，蔡慧霞.气相色谱——质谱联用法测定动物组织中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素的残留量[J].色谱，2006(1):14-18.

[6]GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定[S].

[7]中华人民共和国公告第236号，动物源性食品中兽药检测方法[S].

[8]刘艳琴，王浩，殷晓燕.高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱测定乳品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留的研究[J].食品科学，2008（4）：344-346.

Study on UPLC-MS-MS determination of chloramphenicol residues in milk and dairy

GONG Jun1，CHU Zhong-qiu1，JIANG Jin-dou1，ZHOU Hong2
(1.Ministry of Agriculture Dairy Quality Supervision and Testing Center，Harbin 150090，China;2.National Dairy Quality Supervision and Inspection Center,Harbin 150086，China)

This study of chloramphenicol residues in milk and dairy UPLC-MS-MS determination of the method.The method uses electrospray ionization,multiple reaction monitoring in negative ion mode of chloramphenicol residues in qualitative and quantitative.The detection limit of the method milk 0.05 μg/kg,powder as 0.1 μg/kg,0.4～30.0 μg/L within the linear range of the regression equation was y=798.97+ 1874.56x,r=0.9993,the recovery rate 74.5%to 95.7%,relative standard deviation of 4.6%to 10.3%.The method is simple and convenient sample handling,high sensitivity,short analysis time,etc.,to meet the milk and dairy products-Determination of chloramphenicol residues.

UPLC-MS-MS；chloramphenicol；residual

TS252.7

A

1001-2230（2012）07-0050-03

2012-05-05

巩军（1963-），男，高级工程师，从事食品质量安全与检测技术研究。

姜金斗