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光照调整对于牛乳中褪黑素质量浓度的影响及其检测

2011-01-08任皓威王丹刘鹏姜毓君

中国乳品工业 2011年4期
关键词:巴氏杀菌液相

任皓威,王丹,刘鹏,姜毓君

(东北农业大学黑龙江省乳品工业技术开发中心,哈尔滨 150086)

光照调整对于牛乳中褪黑素质量浓度的影响及其检测

任皓威,王丹,刘鹏,姜毓君

(东北农业大学黑龙江省乳品工业技术开发中心,哈尔滨 150086)

通过调整奶牛的光照周期使牛乳中富含褪黑素成分,并通过液相色谱技术对于富含褪黑素的原料乳进行检测,结果发现褪黑素质量浓度有显著提高。色谱条件:色谱柱Zorbax eclipse XDB C18柱;流动相为甲醇∶水=60∶40,流速为1 mL/min,荧光检测器Ex= 286 nm,Em=345 nm。

褪黑素;光照;牛乳及乳制品;检测

0 引言

褪黑素(Melatonin,MT)主要是由哺乳动物和人类的松果体分泌的一种吲哚类激素。褪黑素的化学式为C13H16N2O2,分子量为232.278 u。在体内主要由肝脏代谢,几小时后可由尿液排出体外。

作为牛乳中发现的主要几中激素类物质之一,且在人乳中也有发现,主要对于光照周期产生反应[1,2]。褪黑素的生物合成受光周期的制约,夜间褪黑素分泌量比白天多5~10倍,在清晨2:00到3:00达到峰值。并据此推测,乳中褪黑素的波动可能是母乳喂养婴儿过程中时间信息沟通的方式[3,4]。

1 试验动物及样品采集

本研究应用泌乳期娟珊奶牛21头,按照光照周期时间及强度不同,分为对照组和试验组I和试验组II。在试验期间,保持牛舍清洁、通风良好,试验用牛只自由饮水采食,并严格保持光照条件进行饲养。

在试验过程中根据奶牛泌乳阶段的不同,分为泌乳初期、泌乳盛期、泌乳中期和泌乳后期4个阶段,每组泌乳期奶牛7头,每头19个采样时点进行乳样采集。样品采集后,立即装入灭菌塑料管-20℃冻存。

2 原料乳及乳制品中褪黑素的检测方法

在本研究中对于原料乳及乳制品中褪黑素的检测,参照了国家标准《保健食品中褪黑素含量的测定(GB/T 5009.170-2003)》、黄宏南等和Peniston-Bird等的检测方法[5-7],并加以改进。

2.1 仪器与试剂

仪器为Agilent 1100LC型高效液相色谱仪;G1321A荧光检测器。

Strata样品提取柱(C18-E 55um,100 mg/mL)。试剂为甲醇(HPLC级)。

2.2 色谱条件

色谱柱Zorbax eclipse XDB C18柱;流动相为甲醇∶水=60∶40,流速为1 mL/min,荧光检测器Ex=286 nm,Em=345 nm,进样量10 μL。

2.3 褪黑素标准溶液的制备

精确称取20 mg褪黑素标准品于100 mL容量瓶中,加入体积分数为70%乙醇溶解后定容至刻度,准确吸取2 mL上述溶液与10 mL容量瓶中,加入流动相,定容至刻度,此溶液质量浓度为0.040 g/L。

2.4 样品前处理

准确量取5 mL乳液于10 mL具塞试管中,加入1∶1盐酸,震荡、超声20 min后取出,离心15 min,过滤。

2.5 样品富集和解析

用针筒吸取10 mL甲醇通过Strata柱,流速为3~5 mL/min,再用20 mL蒸馏水2次冲洗小柱,将甲醇洗净。然后将上述滤液分次通过Strata柱(3~5 mL/ min)富集,再用质量分数为5%甲醇10 mL冲洗2次,加1 mL甲醇解吸,收集解吸液,过0.45 μm微孔滤膜后进样。

2.6 数据处理

试验数据以平均值(X)±标准差(SD)表示,统计分析用SAS软件包的方差分析软件进行分析。试验结果各表中字母相同表示差异不显著(P>0.05),字母不同表示差异显(P<0.05)。

3 巴氏杀菌乳和酸乳的试制

以富含褪黑素的原料乳进行了巴氏杀菌乳的试制。其生产流程如下:

原料储存罐5℃→预热55℃→牛奶标准化→预热66℃→均质200 kg/cm2→杀菌72℃→保温20 s→冷却4℃→巴氏杀菌奶储罐→消毒奶软包装机。

在此基础上,又进行了搅拌型酸奶的试制。其生产流程如下:

巴氏杀菌72℃,15 s→均质150 kg/cm2,60℃→冷却42~43℃→发酵罐,搅拌1~2 min→发酵剂→42~43℃,2.5~3 h→终点pH=4.4,酸度120°T→灌装→包装→冷却7~10℃。

4 结果与分析

4.1 褪黑素标准品色谱图

在色谱条件下,测定褪黑素标准品溶液,得到液相色谱图(图1);测定富含褪黑素乳样品液相色谱图(图2)。

4.2 标准曲线绘制及回收率测定

用定容后的褪黑素标准品溶液,配制标准品质量浓度分别为40,60,80,100,120,140,160,180 ng/L,将标准品依次进样,检测每个质量浓度相应的峰面积,绘制标准曲线。其回归方程为Y=13.95X+1.48(R= 0.998)。按试验方法测定3次回收率,平均可达92%。

4.3 样品测定与结果计算

依次将经前处理后样品进行色谱检测,以标准品峰保留时间定性,并根据样品组分的峰面积在标准曲线上查出相应的褪黑素质量浓度,每个样品检测3次。根据标准曲线进行计算原料乳、巴士杀菌乳及酸奶中褪黑素的浓度。

4.4 样品测定结果

原料乳中褪黑素检测结果数据分别为,对照组为(11.64±0.92)ng/L;试验组I为(29.44±1.02)ng/L;试验组II为(33.15±1.21)ng/L,试验组较对照组有显著提高(p<0.05)(图3)。经液相色谱法检测,高褪黑素质量浓度原料乳经巴氏杀菌后,褪黑素质量浓度变化差异不显著(p>0.05),可保留98%以上,具体数据为巴氏杀菌前为(30.27±1.10)ng/L;巴氏杀菌后为(29.85±0.98)ng/L(图3)。高褪黑素质量浓度原料乳经巴氏杀菌后进行搅拌型酸奶的试制,经液相色谱法检测,褪黑素质量浓度变化差异不显著(p>0.05),可保留95%以上,具体数据为巴氏杀菌前为(29.85±0.98)ng/L;制成搅拌型酸奶后为(29.52±0.89)ng/L(图3)。

3 讨论

褪黑素作为一种大脑产生的激素,帮助调节24小时的身体周期,并且在牛奶中自然存在。乳中的褪黑素具有昼夜模式,既午夜浓度最高,中午浓度最低(表1)[1,2]。褪黑素的产生随年龄增长而下降,从而导致失眠和昼夜节律性变化。血液中褪黑素变化已被证明可改善老人睡眠质量。褪黑素可以帮助调节身体的节律,具有较丰富褪黑素的夜间牛奶,可帮助人们提高睡眠质量。

表1 乳中褪黑素质量浓度比较

Valtonen等2005年为了研究褪黑素(10~40 ng/L,这种剂量水平不影响白天血液中褪黑素的质量浓度)对于老人睡眠质量的作用,采用含有褪黑素的夜间牛奶作为饮料。经研究发现,使用大约0.5 L的褪黑素夜间牛奶可改善老人睡眠质量和生理状况。

由于褪黑素的良好作用,富含褪黑素的乳制品已经成为乳品市场一个新成员。1999年,英格曼乳业的夜间牛奶(高褪黑素牛奶)保留了牛奶中天然褪黑素,尽管价格较高,但由于健康需求,销售一直稳步增长。类似的产品也已经在日本问世(Nakazawa Foods的Adult Milk),英国也有两个牛奶品牌(Cricketer Farm的Night Time Milk和Red Kite的Slumber Bedtime Milk)推出了高褪黑素牛奶。

目前对于褪黑素的分析技术包括放射免疫法、酶联免疫法、气-质联用法、紫外分光光度法、液相色谱法和电化学法等。放射免疫法简单、灵敏,但需要放射性试剂,该方法利用甲醛将褪黑素与牛甲状腺球蛋白连接后免疫新西兰白兔获得高品质褪黑素抗血清,125I标记褪黑素获得标记物,非平衡竞争法建立褪黑素放射免疫分析方法。是乳中褪黑素质量浓度的检测方法较常见的方法之一[1,2,8],但该方法由于其需要使用放射性试剂而受到限制。其他几种方法也因为检测仪器和检测方法灵敏度等的限制,没有被广泛采用。

近年来较多采用的是液相色谱法,高效液相色谱法的色谱条件根据褪黑素是弱极性物质,均采用ODS柱,通过调整流动相即可获得较好的色谱行为,常用甲醇为有机改性剂。大部分测定方法以甲醇-水为流动相,仅是比例有所不同,从70∶30到50∶50[9-11]。

4 结束语

本研究得到的原料乳、巴氏杀菌乳和酸乳中褪黑素质量浓度,经液相色谱检测结果与上富含褪黑素乳制品中褪黑素质量浓度相当。但在我国尚没有类似的产品问世,本研究对于我国的富含褪黑素乳制品生产提供了支持。为提高我国乳制品附加值,为富含褪黑素的功能性乳制品开发提供了依据。

[1]ILLNEROVA H,BURESOVA M,PRESL J.Melatonin Rhythm in Human Milk[J].J Clin Endocrirwl Metab.1993,77:838-841.

[2]ERIKSSON L,VALTONEN M,LAITINEN J T,et al.Diurnal Rhythm of Melatonin in Bovine Milk:Pharmacokinetics of Exogenous Melatonin in Lactating Cows and Goats[J].Acta Vet Scand,1998,39(3):301-310.

[3]LAITINEN,J VAKKURI,O.Breast-feeding provides Rhythmic Source of Melatonin to the Infant.Program of the first European congress of endocrinology,Copenhagen,1987.130

[4]KOLDOVSKY O,ILLNEROVA H,MACHO L,et al.Milk-borne Hormones:possible Tools of Communication between Mother and Suckling[J].Physiol Res.1995,44(6):349-351.

[5]《保健食品中褪黑素含量的测定(GB/T 5009.170-2003)》,2003

[6]黄宏南,林宏琳,牛乳中天然褪黑素HPLC-PDA-FLD测定方法研究[J].中国卫生检验杂志2005,15(10):1216-1217.

[7]PENISTON-BIRD JF,DI WL,STREET CA,et al HPLC Assay of Melatonin in Plasma with Fluorescence Detection[J].Clinical Chemistry,2003,39:2242-2247.

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[11]VIEIRA R,MIGUEZ J,LEMAM,et al.Pineal and Plasma Melatonin as Determined by High-performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection[J].Anal Biochem,1992,205:300-305.

Influence of light rhythm on melatonin in milk and detection

REN Hao-wei,WAN Dan,LIU Peng,JIANG Yu-jun
(Heilongjiang Dairy Industry Technical Development Center,Northeast Agricultural University,Harbin150086,China)

In order to get the melatonin rich milk,the method by adjusting the light rhythm of cows was used.And a method for determination of melatonin in milk and dairy products by high-performance liquid chromatography(HPLC)was used.And then separated on Zorbax eclipse XDB C18 column with a mixed solution of methanol/water 60/40 as mobile phase,and detected at Ex=286 nm,Em=345 nm with a Fluorescence detector.

Melatonin;light;milk and dairy products;detection

TS252.7

A

1001-2230(2011)04-0055-03

2011-01-10

黑龙江省优势农产品生产与加工研发平台产业化项目(193082)。

任皓威(1980-),男,博士,从事乳品科学方面研究。

姜毓君

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