植物乳杆菌B28产细菌素的发酵条件研究

程建军，李想，郭明若，2，吴琼

（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；2.佛蒙特大学，美国伯灵顿 05403）

植物乳杆菌B28产细菌素的发酵条件研究

程建军1，李想1，郭明若1，2，吴琼1

（1.东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030；2.佛蒙特大学，美国伯灵顿 05403）

从来自保加利亚传统燕麦饮料中分离得到的植物乳杆菌B28出发，以腊样芽胞杆菌Baeillus cereus为指示菌，研究了植物乳杆菌B28生长特性以及产生细菌素的最佳时期；不同氮源、碳源和磷酸盐对细菌素抑菌活性性影响以及不同浓度硫酸铵溶液对细菌素的盐析效果。结果表明，植物乳杆菌B28在37℃条件下培养，14～16 h，生长进入稳定期；产生细菌素最佳发酵时间为24 h；70%的硫酸酸铵是适植物乳杆菌细菌素的盐析质量分数为。与对照培养基对比，植物乳杆菌B28的生长情况是酵母提取物＞大豆蛋白＞胰蛋白胨、蛋白胨、肉膏；乳糖＞D-果糖、蔗糖、D-麦芽糖＞D-木糖；磷酸盐对植物乳杆菌B28的生长影响不大。并得到了产生细菌素的最佳培养基配方。

植物乳杆菌；细菌素；培养基

0 引言

长期以来，乳酸菌广泛应用于食品的发酵与防腐中。许多乳酸菌除产生乳酸、乙酸和过氧化氢外，还可产生一些具有抑菌生物活性的细菌素(bacteriocin)，在食品的防腐保鲜方面起重要作用。它是某些细菌核糖体内合成的具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物。

植物乳杆菌素（plantaricin）是植物乳杆菌（L.plantarum）代谢过程中合成并分泌到环境中的一类具有抑制作用的杀菌蛋白或多肽物质。国内外许多研究表明，由乳酸菌产生的细菌素以及其抑菌活性的高低与发酵培养条件有着密切的关系。因此，本研究对来自保加利亚发酵燕麦饮料中分离的植物乳杆菌B-28所产细菌素的发酵条件进行了优化，以期为此细菌素的进一步研究与应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌种和培养基

试验菌为植物乳杆菌Lactobacillus plantarumB28，指示菌为腊样芽胞杆菌Baeillus cereus；基础培养基为MRS培养基和普通肉汤培养基。

1.2 方法

1.2.1 植物乳杆菌生长曲线的测定

在MRS液体培养基中，按106mL-1的比例接种植物乳杆菌，37℃条件下培养，每隔2 h测定发酵液的pH值，同时将发酵液稀释5倍，采用分光光度计测定不同培养时间植物乳杆菌菌悬液的600 nm的吸光值。

将不同发酵时间的植物乳杆菌稀释成不同倍数，MRS固体培养基平板计数，做平行实验，以发酵时间为横坐标，以植物乳杆菌的对数值为纵坐标，绘制生长曲线。

1.2.2 产生细菌素高峰期的确定

在MRS液体培养基中，按106mL-1的比例接种植物乳杆菌，37℃条件下培养，从发酵培养10 h开始，每隔2 h取样，低温条件下8 000 g离心15 min。上清液添加硫酸铵至饱和度70%，4℃下静置1 h，盐析后8 000 g离心15 min，所得沉淀用浓度为20 mmol/L（pH值为6.2）的磷酸盐缓冲溶液溶解，层析纯化后，研究不同发酵时间的植物乳杆菌素抑菌活性的大小。

1.2.3 盐析对细菌素活力的影响

植物乳杆菌发酵液8 000 g离心15 min，向上清液中分别添加硫酸铵至饱和度20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%；4℃下静置1h，然后8 000 g离心15 min，所得沉淀用浓度为20 mmol/L（pH值为6.2）的磷酸盐缓冲溶液溶解，Sephadex-G25层析纯化后，以腊样芽胞杆菌（Baeillus cereus）为指示菌，φ7.8 mm的牛津杯作抑菌试验，以抑菌圈直径大小比较不同饱和度硫酸铵对植物乳杆菌细菌素抑菌活性的影响。

1.2.4 氮源对细菌素产率及活力的影响

将MRS基本发酵培养基中的含氮物质分别选用质量分数为2%的大豆蛋白、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物等作为唯一的氮源，其他成分不变配制培养基，作单因素实验。

按106mL-1的比例接种植物乳杆菌B-28，37℃条件下培养24 h，同时以基本发酵培养基为对照测定发酵液的pH值，同时将发酵液稀释5倍后，在分光光度计上测定600 nm的吸光值。

发酵液8 000 g离心、70%（NH4）2SO4盐析、Sephadex G-25层析。比较不同培养基对植物乳杆菌细菌素抑菌活性的影响。研究不同氮源对植物乳杆菌生长及产生细菌素的影响。

1.2.5 碳源对细菌素产率及活力的影响

将MRS基本发酵培养基中的碳源分别用质量分数为2%的D-果糖、蔗糖、D-木糖、D-麦芽糖和乳糖等不同碳源取代葡萄糖，单因素实验，配制发酵培养基；以研究不同碳源对植物乳杆菌生长及产生细菌素的影响。

1.2.6 磷源对细菌素产率及活力的影响

将MRS基本发酵培养基中的磷酸盐分别用质量分数为0.2%的KH2PO4和NaH2PO4取代MRS中的K2HPO4，配制发酵液。以研究不同磷酸盐类对植物乳杆菌生长及产生细菌素的影响。

1.2.7 最佳培养成分优化培养基

将优化碳源、氮源和磷酸盐后的成分配制成新的发酵培养基，按106mL-1接种植物乳杆菌B-28，37℃条件下培养2 h，同时以原MRS基本培养基为对照，比较优化前后培养基对植物乳杆菌素活性的影响。

2 结果和讨论

2.1 植物乳杆菌生长特性

图1为不同发酵时间植物乳杆菌的生长特性；图2为植物乳杆菌的生长曲线。

由图1和图2可以看出，37℃条件下培养，植物乳杆菌B-28在1～4 h时，生长缓慢，繁殖较少，OD值和菌落总数增长较小，植物乳杆菌处于迟缓期；6～14 h，植物乳杆菌B-28生长迅速，菌体以几何级数增长，OD值和菌落总数迅速增加，产酸速度快，处于对数生长期；发酵大约14～16 h就进入稳定生长期，植物乳杆菌B-28菌数仍在增长，但大体处于稳定状态，说明繁殖数和死亡数大体平衡。

在14 h时，600 nm的OD值突越到0.829；16 h时，pH值大约为3.97，植物乳杆菌数突越到1.51×109mL-1。pH值的变化大约滞后OD值和菌落总数变化2 h，说明了植物乳杆菌物质代谢和积累滞后于菌体的生长。

2.2 细菌素高峰期的确定

从研究结果可以看出，植物乳杆菌的生长稳定期是在发酵14～16 h后，而发酵产物的积累滞后于乳酸菌的生长，因此，本研究从植物乳杆菌B-28发酵10 h后开始测定植物乳杆菌素的抑菌活性，结果如图3所示。

由图3可以看出，在本研究的范围内，随着发酵时间的延长，植物乳杆菌素抑菌活性一直在平稳缓慢增加，10～16 h，抑菌活性逐渐增加，16～22 h处于稳定期，24 h时，植物乳杆菌细菌素抑菌效果达到了最高峰，此后，随着发酵时间的延长，活性又处于一个相对稳定期，因此，本研究确定植物乳杆菌B-28产生植物乳杆菌素最佳的发酵时间为24 h。

2.3 盐析对细菌素活力的影响

图4为不同质量分数硫酸铵盐析对细菌素产量及抑菌活性的影响。由图4可以看出，植物乳杆菌B-28发酵上清液在不同硫酸铵浓度下盐析，对植物乳杆菌素粗品产量和抑菌圈大小的影响，二者变化趋势基本保持一致。

质量分数为20%饱和度的硫酸铵盐析，没有收集到植物乳杆菌粗品的沉淀；随着硫酸铵浓度的增加，植物乳杆菌素粗品的产率逐渐增加，在60%饱和度时，细菌素的得率突增到0.61 g/100mL；70%饱和度时，达到最大得率为0.77 g/100mL；此后，植物乳杆菌素粗品的得率呈现下降趋势，但基本趋于稳定。

植物乳杆菌素的抑菌活力从30%饱和度的硫酸铵盐析后逐渐增加，在60%～70%饱和度的硫酸铵溶液盐析后达到最大，60%饱和度时，抑菌圈直径达到了1.60 cm；70%饱和度时，抑菌圈直径达到了1.57 cm，此后抑菌活力降低，并趋于平稳。

产生这种情况的原因可能是由于低浓度的硫酸铵溶液使植物乳杆菌素的溶解度增加，因此，20%饱和度硫酸铵盐析，没有收集到沉淀；高浓度的硫酸铵溶液使植物乳杆菌素的溶解度降低，得到的沉淀物增加，但高浓度的硫酸铵可能会使植物乳杆菌素的活性降低，因此，植物乳杆菌素在80%～90%饱和度硫酸铵盐析后，活性出现了下降的趋势。

综合植物乳杆菌素粗品的产率和抑菌活性的大小，确定70%饱和度的硫酸铵溶液为最佳盐析浓度。

2.4 氮源对B-28生长及细菌素抑菌活性的影响

在保持总氮质量分数为2%不变的前提下，分别以大豆蛋白、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物等作为唯一氮源，取代MRS基本培养基中的蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物组成的混合氮源对植物乳杆菌B-28的生长特性及植物乳杆菌素抑菌活性的影响如图5和图6所示。

由图5可以看出，OD值和pH值变化趋势是相互吻合的，即植物乳杆菌数量的增长和产生乳酸的变化趋势基本吻合的。

以基本发酵培养基为对照，在不同氮源中，植物乳杆菌B-28的生长情况是以酵母提取物作为氮源的培养基优于基本发酵培养基，而大豆蛋白与基本发酵培养基效果基本一致，胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏单独作为氮源所产生植物乳杆菌素的抑菌作用低于对照，如图6所示。

在相同培养条件下，不同氮源对植物乳杆菌素的活性影响大小依次为大豆蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、胰蛋白胨和牛肉膏，而且植物乳杆菌B-28在含大豆蛋白胨、酵母提取物培养基中所产生的植物乳杆菌素活力明显高于对照。

大豆蛋白胨能够有效促进植物乳杆菌的生长和植物乳杆菌素抑菌活性的提高，可能是由于植物乳杆菌B-28本身就是分离于传统保加利亚发酵小麦饮料，所利用的氮源与大豆蛋白胨中所含有的氨基酸同源或是氨基酸组成比较相似的缘故。因此，最佳氮源为大豆蛋白胨和酵母提取物，并作进一步的复配研究。

2.5 碳源对B-28生长及细菌素抑菌活性的影响

在保持总碳质量分数2%不变的前提下，分别以D-果糖、蔗糖、D-木糖、D-麦芽糖和乳糖作为唯一碳源取代MRS基本培养基中的葡萄糖，其对植物乳杆菌B-28的生长特性及植物乳杆菌素抑菌活性的影响如图7和图8所示。由图7和图8可以看出，植物乳杆菌生长曲线和酸度（pH值）的变化趋势基本吻合。

以基本发酵培养基为对照，在不同碳源中，植物乳杆菌B-28在乳糖为碳源的培养基上生长，OD值高于对照，说明乳糖特别适用于乳酸菌的生长；D-果糖、蔗糖、D-麦芽糖与对照培养基的生长状况基本相似，但D-木糖促进植物乳杆菌生长的效果最差，OD值最小，说明D-木糖不适于植物乳杆菌B-28的生长。

在相同培养条件下，不同碳源对植物乳杆菌素的活性影响大小依次为D-果糖、D-木糖、蔗糖、D-麦芽糖，虽然植物乳杆菌在乳糖为碳源的培养基上生长旺盛，但其产生的植物乳杆菌素没有活性。

氮源对植物乳杆菌生长和植物乳杆菌素抑菌活力方面并没有表现出一致性，乳糖对植物乳杆菌的生长最有利，但却没有任何抑菌活性；D-木糖对植物乳杆菌的生长促进作用较小，但抑菌活性与对照比较接近，其原理有待进一步探讨研究。

综合植物乳杆菌生长和植物乳杆菌素的活性，确定D-果糖为最佳碳源。但考虑到经济成本问题，将D-果糖与基本培养基中的葡萄糖作复配研究。

2.7 磷源对B-28生长及细菌素抑菌活性的影响

图9为磷酸盐对植物乳杆菌生长的影响；图10为磷酸盐对植物乳杆菌素抑菌活性的影响。由图9和图10可以看出，KH2PO4和NaH2PO4对植物乳杆菌B-28的生长和植物乳杆菌素抑菌活性的影响，与基本培养基相比，NaH2PO4作生长因子的培养基OD值略高一些；KH2PO4作生长因子的培养基，其植物乳杆菌素的抑菌活性略高，差异不明显。因此确定磷源不采用新的磷酸盐，因此确定采用原基本培养基中的K2HPO4。

2.8 优化培养基对细菌素活性的影响

将已经确定的最优氮源和碳源取代基本培养基中的氮源和碳源，以基本培养基为对照，其对植物乳杆菌素抑菌活性的影响结果如图11所示。由图11可以看出，其抑菌活性明显高于对照，抑菌圈的直径大约是对照的130%。因此，确定生产植物乳杆菌素的优化培养基配方（1 L）为：大豆蛋白胨15 g，酵母提取物5 g，D-果糖5 g，葡萄糖15 g，柠檬酸钠2 g，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，MgSO4·7H2O为0.58g，MnSO4·4H2O为0.25 g，吐温80为1 mL。

3 结论

（1）植物乳杆菌B28在37℃条件下培养，14～16 h，生长进入稳定期，pH值和菌数的变化滞后于OD值变化。植物乳杆菌B28产生细菌素的高峰期在培养发酵24 h。

（2）硫酸铵饱和度为70%时，是适植物乳杆菌细菌素的盐析浓度。

（3）最佳成分优化后，植物乳杆菌抑菌活性提高了30%，植物乳杆菌B-28产植物乳杆菌素最佳培养基配方（1L）为：大豆蛋白胨15 g，酵母提取物5 g，D-果糖5 g，葡萄糖15 g，柠檬酸钠2 g，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，MgSO4·7H2O为0.58 g，MnSO4·4H2O为0.25 g，吐温80为1 mL。

[1]常峰，易奎星，刘小兰，等.类细菌素高产菌CF10的筛选诱变及发酵条件的研究[J].食品科学.2006,27（1）：143-147.

[2]侯运华，孔健，郝运伟，等.一株乳酸菌产类细菌素EnteriocinLK-S1的初步研究[J].山东大学学报：理学版，2002，37（5）：463-467.

[3]贾建波，卜春文，李东.抗菌肽产生菌的选育与发酵条件研究[J].食品工业科技.2002，23（12）：25-28.

[4]李平兰，张篪，江汉湖.产细菌素植物乳杆菌菌株的筛选及其细菌素生物学特征研究[J].食品与发酵工业.1999，25（1）：1-4.

[5]杨颖，THAPA D，陈卫，等.植物乳杆菌HO-269产抗菌肽的培养条件[J].食品与生物技术学报，2006，25（6）：102-106.

[6]ANDERSSEN ERLEND L,DIEP D B,INGOLF F N,et al.Antagonistic Activity of Lactobacillus plantarum C11:Two New Two-Peptide Bacteriocins，Plantaricins EF and JK,and the Induction Factor Plantaricin A[J].Applied and Environmental Microbiology，1998，6:2269-2272.

[7]RUFINO J,JOSE'L R,DECLAN P C,et al.Purification and Partial Amino Acid Sequence of Plantaricin S,a Bacteriocin Produced by Lactobacillus plantarum LPCO10,the Activity of Which Depends on the Complementary Action of Two Peptides[J].Applied and Environmental Microbiology，1995，11:4459-4463.

[8]LEAL-SA'NCHEZ M V,JIME'NEZ-DIAZ R,MALDONADOBARRAGA?N A,et al.Optimization of Bacteriocin Production by Batch Fermentation of Lactobacillus plantarum LPCO10[J].Applied and Environmental Microbiology.2002，9:4465-4471.

[9]NILSSON L,MICHAEL K N,YIN N,et al.Role of Acetate in Production of an Autoinducible Class IIa Bacteriocin in Carnobacterium piscicola A9b[J].Applied and Environmental Microbiology，2002，5: 2251-2260.

[10]PAYNTER M J B,BROWN K A,HAYASAKA S S.Factors Affecting the Production of an Antimicrobial Agent,Plantaricin F,by Lactobacillus plantarum BF001[J].Letters Applied Microbiology，1997，24:159-165.

Optimization of bacteriocin production by Lactobacillus plantarum B28

CHENG Jian-jun1，LI Xiang1，GUO Ming-ruo1，2，WU Qong1
（1.Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.University of Vermont，Burlington 05403，USA）

Lactobacillus plantarumB28，which is a strain isolated from traditional Bulgarian oat beverage，produces a bacteriocin which is inhibitory toBaeillus cereus.The growth characteristic ofLactobacillus plantarumB28and the optimal stage of producing bacteriocin were studied.The different cultures and different concentrations of ammonium sulphate effect on bacteriocin activity was observed.The growth cycle of B28was studied at 37℃which indicated its stationary phase starting from the 14 th hour to the 16th hour.The bacteriostatic activity of plantaricin, produced by the strain has been improving constantly.It reached the peak value at 24 h.L.Plantarumgrew better in media in presence of yeast extract,soybean protein,lactose,D-fructose,sucrose,or D-maltose.D-xylos was not suitalbe forL.Plantarum.There was no considerable effect when it grew in KH2PO4and NaH2PO4.The optimized medium was achieved.

Lactobacillus plantarum；Bacteriocin；medium

Q93-335

A

1001-2230（2011）04-0016-04

2011-01-21

程建军（1969-），男，博士，从事农产品加工方面的研究。