目安眼膏抗单纯疱疹病毒的最佳浓度研究

张湘晖王 适 何 群伍参荣谭涵宇姜 宇赵碧清张 健

2湖南中医药大学第二中医临床学院

3湖南中医药大学

阿昔洛韦（acyclovir，ACV）是治疗单纯疱疹病毒性角膜炎（HSK）的首选药物，但ACV对角膜修复、愈合及再生能力欠佳，单纯应用很难控制病毒抗原引起的免疫性炎症反应。前期研究发现〔1-3〕，蜂蜜与ACV配伍制成的目安眼膏，既能增强治疗HSK的药效，又能提高角膜修复、愈合及再生能力，但药效与蜂蜜浓度密切相关。为进一步验证前期研究成果，讨论5%蜂蜜是否为最佳浓度，本实验采用透射电镜观察含0%、3%、5%、7%蜂蜜的目安眼膏与市售阿昔洛韦眼膏（不含蜂蜜）的作用效果，为目安眼膏处方设计提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康成年新西兰大白兔由长沙市开福区东创实验动物科技服务部提供，雌雄各半，体重2.00～2.50 kg，共 28只（56眼），健康无眼疾（动物合格证号scxk（湘）2006-0001）。

1.2 实验药品及设备

Hela细胞（湘雅医学院细胞中心）；0.1 mol/L磷酸缓冲液（PBS）、2.5%戊二醛固定液（中南大学湘雅医学院电镜室）。生理盐水（武汉滨湖双鹤药业有限责任公司，080421405）；荧光素钠（湖南中医药大学第一中医临床学院药剂科）；表面麻醉剂（0.4%Benoxil溶液，日本参天制药株式会社）；3%阿昔洛韦眼膏（上海通用药业股份有限公司，批号080301）；紫云英蜂蜜（湖南省药材公司，经我院周日宝教授鉴定符合《中国药典》2005版第一部规定）；阿昔洛韦（湖北科益药业股份有限公司）；目安眼膏：采用蜂蜜与阿昔洛韦为主要成分，加入眼膏凝胶基质配制而成；卡波姆－940、吐温－80、司盘－80、尼泊金乙醋，甘油，氢氧化钠，蒸馏水，皆符合药用规格。透射电镜：H-600 型（日本 HⅠTACHⅠ公司）。

1.3 毒株

单纯疱疹Ⅰ型病毒株由湖南中医药大学微生物免疫学教研室提供，在非洲绿猴肾细胞中传代。造模所用的 HSV-1的半数组织培养感染量（TCⅠD50）是 10-5.61。

1.4 实验方法

1.4.1 动物造模

参照角膜环钻压痕法〔4〕及上皮划痕法〔5〕。 操作：0.5%地卡因表面麻醉，6 mm环钻在角膜中央作一压痕，并在其压痕内作“#”划痕（深度仅限上皮层），微量取样品25 μl病毒悬液，滴入兔双眼结膜囊内，闭合眼睑并按摩1分钟，接种48小时后观察，动物均有畏光、流泪、角膜出现点状、树枝状和地图样着色及角膜基质深浅不一的水肿混浊，提示造模成功。

1.4.2 动物分组

按兔眼病情轻重分层，采用随机对照表法将模型兔随机分为7组，每组4只（8眼）。即：Ⅰ组：含0%蜂蜜和3%ACV目安眼膏组；Ⅱ组：含3%蜂蜜和3%ACV目安眼膏组；Ⅲ组：含5%蜂蜜和3%ACV目安眼膏组；Ⅳ组：含7%蜂蜜和3%ACV目安眼膏组；Ⅴ组：模型组（阴性对照组）；Ⅵ组：市售3%阿昔洛韦眼膏组（阳性对照组）；Ⅶ组：凝胶基质组（空白组）。

1.4.3 给药方法〔5〕

每日涂眼药3次，每次给药约0.1 g，间隔4小时（8时、12时、16时），双眼接受同样治疗，共 12天。每次给药前生理盐水冲洗5分钟，保证水的流量和流速都不会导致眼损伤。

1.4.4 电镜观察

用药后第9天，分别从7组中抽取一只兔（取角膜病变接近平均计分）〔6〕，生理盐水冲洗结膜囊分泌物和染色剂，兔夹子固定兔，空气栓塞法处死〔7〕。摘取角膜，电镜观察。步骤〔8〕：沿角膜缘剪下角膜放入2.5%戊二醛中进行前固定，0.1 mol/L PBS漂洗，1%锇酸后固定，0.1 mol/L PBS漂洗，丙酮梯度脱水（50%、70%、90%、100%），Epon812环氧树脂包埋与100%丙酮1∶1比例浸泡，Epon812环氧树脂浸泡、包埋，瑞典LKB公司11880型修块机修块定位，醋酸铀、硝酸铅双重染色，透射电镜观察、拍片、记录。

2 结果

用药后第9天，通过透射电镜观察可见：

Ⅰ组：角膜上皮表面微绒毛脱落，上皮细胞间隙增宽，内质网部分轻度扩张，线粒体嵴丢失（图1）。基质层结构排列疏松，纤维细胞典型空泡变，线粒体肿胀，染色质边集，组织间隙水肿（图2）。

Ⅱ组：角膜上皮表面微绒毛基本消失，可见上皮细胞核轮廓，细胞间桥粒松解、破坏，空泡化不明显，细胞质结构紊乱，胞核开始裂解（图3）。基质层形成调亡小体形成（图4）。细胞层次可见3～4层上皮细胞核，细胞间连接模糊，染色质边集，胞浆局部空泡，细胞核肿胀（图5）。

Ⅲ组：角膜上皮表面微绒毛丰富，细胞层次有7～8层排列规则、相互重叠的扁圆形细胞核，核形较规则，染色质部分边集，细胞器发达，粗面内质网较多，无肿胀，细胞间连接紧密，细胞外胶原纤维结构排列整齐，基质中成纤维细胞形态正常，呈长梭形还可见纤维细胞突起（图6）。

Ⅳ组：角膜上皮表面微绒毛部分恢复，但稀疏、短小，排列欠规则。细胞浆中线粒体轻度肿胀，呈椭圆形，嵴结构可见，粗面内质网轻度扩张，细胞结构排列较整齐，细胞桥粒连接松散，细胞空泡变仍明显（图7）。基质中成纤维细胞基本正常，呈长梭形，核形规则，线粒体结构正常（图8）。

Ⅴ组（阴性对照组）：上皮微绒毛脱落，上皮细胞层缺损，且变薄，排列结构紊乱，细胞膜受损，细胞间隙不清，细胞器结构紊乱不清。基质层纤维排列紊乱、细胞局灶性溶解、坏死（图9）。

Ⅵ（阳性对照组）：微绒毛稀疏，细胞层变薄，排列相对规则，上皮细胞局部有虫蚀状变性，细胞连接增宽，细胞结构排列欠整齐，细胞核皱缩，细胞器结构不清，部分仍有空泡变（图10）。

Ⅶ组（空白组）：微绒毛脱落，上皮细胞变性坏死，上皮层受损至深部。基质层局灶性撕裂，破损，溶解。纤维细胞变性、固缩、坏死，电子密度增高，胞浆空泡变，纤维细胞局灶性溶解（图11）。

3 讨论

目安眼膏与市售阿昔洛韦眼膏均含3%ACV，不同点是市售阿昔洛韦眼膏不含蜂蜜，与目安眼膏基质不同。通过电镜观察，含5%蜂蜜的目安眼膏组用药后兔角膜上皮表面微绒毛丰富，细胞层次排列规则，相互重叠的扁圆形细胞核，核型较规则，细胞器发达，粗面内质网较多，无肿胀，细胞间连接紧密，细胞外胶原纤维结构排列整齐，基质中成纤维细胞形态正常。细胞结构、形态恢复均优于其它各组。表明含5%蜂蜜的目安眼膏可减轻阿昔洛韦药物分子非靶向性对正常角膜上皮细胞的损害，保护角膜正常上皮，同时可加强网状上皮细胞的吞噬能力。这可能与蜂蜜能增强免疫力，对创面有收敛、保护及愈合等作用有关。蜂蜜又是祖国医学中制眼膏、丸药的基质，不与主药起反应，是配置眼膏的理想增强剂。

本实验表明蜂蜜与ACV配伍能增强对HSV-1的抑制作用，并有促进角膜上皮修复、愈合、再生作用。目安眼膏蜂蜜的最佳浓度为5%。

1 谭海波，张湘晖，张明亮，等.目安眼膏治疗实验性家兔单纯疱疹性角膜炎研究[J].中国中医眼科杂志，2003，13（1）：12-13.

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3 王霜玲，张湘晖，何 群，等.目安眼膏治疗兔单纯疱疹性角膜炎的研究[J].中国中医眼科杂志，2007，17（5）：283-286.

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5 吴幼锐.实验性家兔HSV-1角膜炎的扫描电镜改变[J].眼科学报，1987，3（1）：47.

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