复方健胰颗粒对STZ诱导糖尿病大鼠白内障防治作用研究

王晓玉 夏伦祝 高家荣 汪永忠 孟 楣 陈晓雯 马鹏天

2安徽省中医院内分泌科

3安徽省中医院眼科

随着糖尿病（diabetes mellitus，DM）患者日益增多，糖尿病性白内障或白内障伴有糖尿病者亦有增多趋势〔1〕。研究糖尿病引起白内障的发生、转归具有重要的临床意义。越来越多的研究显示，糖基化在糖尿病患者白内障的发生中起着关键作用〔2〕。晚期糖基化终产物（advanced glycosylation end products，AGEs）是一类非酶催化的大分子糖基化产物。正常人体内AGE的生成与清除处于平衡状态，但由于糖尿病患者长期处于高血糖水平，体内AGE的生成异常增加并大量堆积，导致一系列病理变化，最终造成糖尿病慢性并发症如白内障等〔3〕。糖化血红蛋白（HbA1c）是指血液中和葡萄糖结合了的一部分血红蛋白，是反映慢性并发症发生的重要指标〔4〕。复方健胰颗粒是安徽省中医院内分泌科名老中医在几十年临床经验基础上研发的医院制剂。该方由黄芪、葛根、苦丁茶、丹参、荔枝核等多种中药组成，具有益气养阴，化浊通络的作用，主要用于治疗2型糖尿病、代谢综合症及其引起的慢性血管并发症等。本研究通过复方健胰颗粒作用于STZ诱导的糖尿病大鼠，以氨基胍 （aminoguanidine，AG）为阳性药，观察大鼠晶状体的变化、血浆 HbA1c 及 HbA1（a＋b＋c）变化、血浆及晶状体中AGEs的变化，初步探讨其是否对糖尿病引起的白内障具有预防和治疗作用。

1 材料

1.1 动物

普通级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠80只（由安徽医科大学动物中心提供，合格证号：皖实动准字第 01 号），体重为 150～180 g。在恒温（22℃）、相对湿度65%～75%的环境中适应性饲养1周。实验前，大鼠尾静脉取血，血糖仪检测血糖，排除血糖异常的大鼠；裂隙灯检查，排除晶状体及角膜异常的大鼠。最终符合实验要求的大鼠共60只。

1.2 药品与试剂

STZ（SⅠGMA-S0130-1G，CAS Number：18883-66-4）；柠檬酸（AR，批号：T20090224，国药集团化学试剂有限公司）；柠檬酸三钠（AR，批号：F20081014，国药集团化学试剂有限公司）；复方健胰颗粒（安徽省中医院制剂中心提供，批号：20090205）；盐酸氨基胍（TOKYO，东京化成工业株式会社，A1129，B53610B）；托吡卡胺滴眼液（武汉五景药业有限公司，批号：09090201）；大鼠糖基化终产物（AGE）酶联免疫分析试剂盒（购自美国R&D公司，编号DZE32545146）。

1.3 主要仪器

电子天平（Sartorius-BP211D 型）；pH 计（Sartorius-PB-20型）；冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂，型号TGL-16G）；裂隙灯显微镜（瑞士HAAG-STRE-ⅠT 公司，型号：BD900）；血糖仪（Optium Xceed，美国Abbott Diabetes Care Ⅰnc.型号：XCE687-2107）；糖化血红蛋白分析仪（美国伯乐公司，型号：BⅠO-RAD D-19，HPLC-离子交换色谱法）；酶标仪（美国BioTek公司，型号：EL406）。

2 方法

2.1 STZ致糖尿病大鼠模型的制备

参照文献方法〔5〕，以65 mg/kg的注射量对SD大鼠腹腔注射1%STZ枸橼酸溶液（0.22 μm微孔过滤器过滤），同时向正常组大鼠腹腔注射等量的枸橼酸溶液。72h后，取鼠尾静脉血，血糖试纸测空腹血糖值。挑选血糖值稳定并高于16.7 mmo1/L的大鼠备用。

2.2 动物分组及给药方案

大鼠随机均分为5组：正常组、模型组、治疗1组（2.5 g/kg，相当于临床每日给药剂量的5倍），治疗2组（5.0g/kg，相当于临床每日给药剂量的10倍），AG组（0.1 g/kg），n=12。预防给药：于造模成功后第1周至第8周分别连续灌胃（1 ml/100g）给药，每日1次，正常组及模型组给予等量溶媒，连续8周。

2.3 1%STZ溶液制备

0.1 mol/L柠檬酸缓冲液的制备：A液：取枸橼酸2.101 g，溶于100 ml蒸馏水；B液：取枸橼酸三钠2.941 g，溶 于100 ml蒸 馏 水 。 取A 液114 ml，B 液86 ml，混合均匀，pH计测实际 pH 值为4.25，用0.22 μm微孔过滤器过滤，即得，4℃保存。造模前，取1 g STZ溶于100 ml 0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中混匀，即为1%STZ溶液，应新鲜配制。

2.4 测试指标及方法

①一般状态的观察：行为、状态、体征、饮水量、摄食、尿量、体重等。②血糖变化：各组大鼠分别于造模前、造模后72h、造模后第8周末取各组鼠尾静脉血，血糖试纸测血糖。③裂隙灯显微镜检查并记录大鼠晶状体变化。按照何守志报道的方法将晶状体混浊程度分为 0-Ⅴ期〔6〕：0 期：晶状体透明；Ⅰ期：晶状体周边皮质散在细小空泡；Ⅱ期：晶状体周边皮质呈环状密集中等空泡；Ⅲ期：除晶状体周边皮质密集空泡外，部分皮质片状混浊；Ⅳ期：晶状体核及核周皮质混浊；Ⅴ期：晶状体完全混浊。④HbA1c及HbA1（a＋b＋c）水平测定：股动脉放血处死大鼠，抗凝管收集血浆，采用HPLC-离子交换色谱法，糖化血红蛋白分析仪测定。⑤血浆及晶状体中AGEs的含量检测：股动脉放血处死大鼠，收集血浆；立即摘取左眼眼球，分离晶状体，用冷生理盐水制成10%的晶状体匀浆并离心（3 000 r/min），吸取上清液。按R&D公司提供的ELⅠSA试剂盒说明书对血浆及晶状体中AGEs的含量进行测定。

2.5 统计方法

3 结果

3.1 一般形态学观察

模型组大鼠于造模后，就出现典型的 “三多一少”症状，从第2周开始逐渐消瘦，体重与正常组大鼠相比，差异具有统计学意义（P＜0.01），且体毛脱落、性情易惊躁，多发四肢及尾部溃烂感染等症，出现3只死亡现象，死亡率占25%。正常组大鼠随时间增加体重增长，生存状态良好。经药物干预后，无论是治疗1组和治疗2组，还是阳性对照AG组，对大鼠体重的减轻均有不同程度的改善作用，且大鼠的生存状态明显优于模型组。其中，实验结束时治疗1组大鼠体毛洁净，摄食饮水量明显减少，活泼好动，死亡率仅为8.3%；治疗2组死亡率占16.7%；AG组对体重也有改善作用，死亡率为8.3%（表1）。

表1 各组大鼠在不同时间的体重变化（±s，n=12）

表1 各组大鼠在不同时间的体重变化（±s，n=12）

注：①与正常组相比，P＜0.01；②与模型组相比，P＜0.05；③与模型组相比，P＜0.01。

3.2 裂隙灯显微镜观察

给药第8周末，裂隙灯显微镜记录各组大鼠晶状体变化情况。正常组大鼠晶状体始终保持透明，为0期（图1）；模型组大鼠晶状体皮质部呈现明显片状或剑竹状向前极放射的结晶，为Ⅲ期，占41.2%，Ⅳ期混浊占35.3%，部分晶状体完全混浊，为Ⅴ期，占23.5%（图2）；治疗1组大鼠晶状体周边皮质散在细小空泡或中等空泡密集，为Ⅰ～Ⅱ期，分别占33.3%，Ⅲ期混浊占22.2%，Ⅳ期混浊占5.6%，Ⅴ期混浊占5.6%（图3）；治疗2组大鼠晶状体呈现扩大的条纹状结晶，晶状体核心尚透明，为Ⅲ期，占44.4%，Ⅳ期混浊占38.9%，Ⅴ期混浊占16.7%（图4）；AG组大鼠晶状体透明，为0期，占33.3%，Ⅰ期混浊占27.8%，Ⅱ期混浊占22.2%，Ⅲ期混浊占16.7%（图5）。

表2 各组大鼠在第8周末时晶状体的混浊程度

3.3 血糖及糖化血红蛋白含量

给药第8周末，股动脉放血处死各组大鼠，血糖试纸测血糖；抗凝管收集各组大鼠血浆约5 ml，糖化血红蛋白分析仪测定各组 HbA1a、HbA1b、HbA1c及HbA1（a+b+c）水平的变化。结果显示，与正常组相比，模型组的血糖、HbA1c和HbA1（a+b+c）的含量明显升高（P＜0.01）；与模型组相比，AG 组能显著降低血糖（P＜0.05），对HbA1c 和 HbA1（a+b+c）的含量影响较小，差异没有统计学意义（P＞0.05）；与模型组相比，治疗1组和治疗2组差异均没有统计学意义（P＞0.05），但两组均有缓慢降低血糖、HbA1c 及HbA1（a＋b＋c）含量的趋势，且治疗 1 组效果好于治疗2组（表3）。

表3 各组大鼠在第8周末时糖化血红蛋白及血糖情况（±s，n=9）

表3 各组大鼠在第8周末时糖化血红蛋白及血糖情况（±s，n=9）

注：①与正常组相比，P＜0.01；②与模型组相比，P＜0.05。

3.4 血浆及晶状体中AGEs含量

结果显示，第8周末时，与正常组相比，模型组血浆及晶状体中的AGEs的含量均显著升高（P＜0.01），且晶状体比血浆中的AGEs水平高得多；与模型组相比，治疗1组和治疗2组均能降低血浆及晶状体中的AGEs的含量，差异具有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），治疗 1 组效果更为明显（表4）。

表4 各组大鼠在第8周末时血浆及晶状体中AGEs 的含量 （±s，n=9）

表4 各组大鼠在第8周末时血浆及晶状体中AGEs 的含量 （±s，n=9）

注：①与正常组相比，P＜0.01；②与模型组相比，P＜0.05； ③与模型组相比，P＜0.01。

4 讨论

糖尿病继发白内障的发生与晶状体蛋白过度糖基化、氧化应激以及渗透压等因素有着直接的关系〔7〕。越来越多的研究显示，糖基化在糖尿病患者白内障的发生中起着关键作用〔8〕。蛋白糖基化是指蛋白质的氨基组与糖的醛基组结合，首先形成不稳定的schiff碱，再经过分子重排，形成稳定的AGEs。AGEs分子之间可以通过交联形成大分子物质，沉积在各种组织器官，从而导致组织器官包括眼晶状体的病变〔9〕。

氨基胍（aminoguanidine，AG）是抑制 AGEs形成的一个经典药物〔10〕。AG对早期糖基化过程中Schiff碱基缓慢的化学重排也有一定抑制作用，同时还可抑制晶状体蛋白糖基化生成的Amadori产物上碳酰基的反应性，从而抑制晚期糖基化产物生成和蛋白质交联〔11，12〕。 有研究表明，AG 可抑制 STZ 糖尿病大鼠白内障晶状体内的AGEs荧光产物的形成，延缓白内障的发展〔13〕。

HbA1c是指血液中和葡萄糖结合了的一部分血红蛋白，反映的是检测前120d内的平均血糖水平，不受空腹血糖以及胰岛素治疗等影响，是更直观的对自身血糖水平情况的反映。许多研究均认为〔14〕，糖化血红蛋白的控制情况是否良好，与并发症的发生概率有着一定的相关性。糖化血红蛋白长期高居不下的患者比一般血红蛋白控制较为理想的患者发生并发症的概率要高。有文献报道，HbA1c每增加1%其慢性并发症平均增加12%，HbA1c每下降1%，可以使糖尿病死亡的危险下降21%，心脏病发作减少14%，微血管并发症下降37%，周围血管疾病减少43%。因此HbA1c也是反映慢性并发症发生的重要指标〔15〕。

因此，本研究选择以上两个指标进行观察。结果发现，复方健胰颗粒（2.5，5.0 g/kg）可以不同程度地降低DM大鼠的死亡率、提高生存质量、减轻晶状体混浊程度；能降低DM大鼠血浆及晶状体中AGEs含量（P＜0.05），缓慢降低血糖、血浆中 HbA1c 及HbA1（a＋b＋c）的水平。说明复方健胰颗粒对STZ诱导糖尿病大鼠白内障的发生发展具有抑制作用，但不是像西药如胰岛素等，通过直接降低血糖来缓解症状，可能是通过中药方益气养阴，化浊通络作用，来调节机体内环境，改善机体内分泌功能。结果提示该作用可能与其减少血浆及晶状体中AGEs水平有关，具体作用机制有待于下一步探索。

1 Ⅰvers RQ，Cumming RG，Mitchell P，et al.Diabetes and risk of fracture：The Blue Mountains Eye Study[J].Diabetes Care，2001，24（7）：1198-1203.

2 Wong TY，Loon SC，Saw SM.The epidemiology of age related eye diseases in Asia[J].Br J Ophthalmol，2006，90（4）：506-511.

3 Fosmark DS，Torjesen PA，Kilhovd BK，et al.Ⅰncreased serum levels of the specific advanced glycation end product methylglyoxal-derived hydroimidazolone are associated with retinopathy in patients with type 2 diabetes mellitus[J].Metabolism，2006，55（2）：232-236.

4 王安芳.309例患者糖化血红蛋白检测的结果及临床意义[J].中国实用医药，2009，4（29）： 79-80.

5 叶春玲，魏 明，冯 娟，等.消渴通络颗粒对糖尿病大鼠周围神经病变的作用研究[J].中国新药杂志，2009，18（23）：2245-2249.

6 何守志，尹素云，宋 琛.半乳糖性白内障形成及逆转的实验研究[J].中华眼科杂志，1987，23（1）：39-42.

7 杨 方，严 宏.糖尿病性白内障的发病机制和药物治疗[J].第四军医大学学报，2004，25（18）：1717-1719.

8 Wong TY，Loon SC，Saw SM.The epidemiology of age related eye diseases in Asia[J].Br J Ophthalmol，2006，90（4）：506-511.

9 Ahmed N.Advanced glycation end-products-role in pathology of diabetic complications[J].Diabetes Res Clin Pract，2005，67（1）：3-21.

10 Thornalley PJ.Use of aminoguanidine（Pimagedine） to prevent the formation of advanced glycation endproducts[J].Arch Biochem Biophys，2003，419（1）：31-40.

11 SwamyMS，Green K，Abraham EC.Ⅰnhibition of cataracts in moderately diabetic rats by aminoguanidine[J].Exp Eye Res，1996，62（5）：505-510.

12 ReddyVP，BeyazA.Ⅰnhibitorsof the maillard reaction and AGE breakers as therapeutics for multiple diseases[J].DrugDiscoveryToday，2006， 13（11）：646-654.

13李 才，刘忠英，候方玉.糖基化终产物形成抑制剂的研究进展[J].中国新药杂志，2001，10（2）：85-87.

14钟伟荣.糖化血红蛋白值测量的重要性及其价值[J].中国医药指南，2010，8（8）：37-38.

15 Tumer RC.The U.K.Prospective diabetes study[J].Diabetes，1998，21（Suppl 3）：35-38.