复方咳喘消颗粒液相指纹图谱研究

邓力为 倪健 沈小春

（北京中医药大学中药学院，北京 100102）

复方咳喘消颗粒由辛夷、金银花、乌梅、五味子、北葶苈子、钩藤、半夏、瓦楞子、秦皮等药味组成，主要用于急、慢性支气管炎(包括慢支急性发作)，喘息性气管炎等的治疗。其制备工艺包括醇提、水提两部分，君药为辛夷、金银花。该颗粒剂处方药味较多，药量大，而原有质量标准仅针对两味君药的指标性成分进行定性、定量分析，难以控制方剂的整体物质群，无法保证制剂的质量。本实验采用HPLC法对复方咳喘消颗粒指纹图谱进行研究，以期完善复方咳喘消颗粒的质量标准，同时对颗粒剂、中间提取物（醇提、水提）及处方中的药材指纹图谱进行对照分析，阐明颗粒剂指纹图谱共有峰的来源，为复方制剂的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Aglient 1100高效液相色谱仪（在线真空脱机，四元梯度泵，手动进样器，DAD检测器）；Hamilton进样针（25μL）；BP211D 电子天平（德国赛多利斯）；CX-300超声波清洗机（北京医疗设备二厂）。

复方咳喘消颗粒 （批号为 061212、070402、070406、070410、070524、070629、070707、070729、070803、070815），由北京中医药大学GMP车间提供；水提浸膏、醇提浸膏（批号为 061212、070402、070406、070410、070524、070629、070707、070729、070803、070815），由北京中医药大学 GMP车间提供；辛夷、金银花、乌梅、紫菀、五味子、北葶苈子、钩藤、半夏、瓦楞子、秦皮药材，购自安国以岭中药饮片有限公司，经鉴定各药均需符合中国药典2005年版一部项下的有关要求。

木兰脂素对照品（批号：882-200102）、绿原酸对照品（批号：110753-200413）、五味子醇甲对照品（批号：110857-200406）、秦皮甲素对照品（111731-200501）、秦皮乙素对照品（110741-200506），均购于中国药品生物制品检定所。

乙腈（Fisher公司，色谱纯），屈臣氏蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 测定条件

色谱柱：依利特 Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液。流速：1.0 mL/min；检测波长：240 nm。柱温：室温；进样量：10 μL，梯度洗脱条件见2.6.2。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取木兰脂素、绿原酸、五味子醇甲、秦皮甲素、秦皮乙素对照品适量，用甲醇溶液分别制备成0.1 mg/mL的溶液，即得。

2.3 样品溶液的制备

取颗粒剂4.0 g，精密称定，精密加入甲醇20 mL，称定重量，超声30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 水提（醇提）浸膏溶液的制备

精密称取水提（醇提）浸膏1.0 g，精密加入甲醇20 mL，按样品溶液的制备方法制备，即得。

2.5 药材溶液的制备

精密称取辛夷、金银花、乌梅、紫菀、五味子、北葶苈子、钩藤、半夏、瓦楞子、秦皮药材适量，精密加入甲醇20 mL，按样品溶液的制备方法制备，即得。

2.6 色谱分离条件优化

2.6.1 流动相系统选择 比较了流动相：甲醇-水、乙腈-水系统，发现乙腈-水系统分离效果更好，且柱压较低，选择乙腈-水系统，并对其进行梯度优化。

2.6.2 梯度优化 以HPLC指纹图谱中各峰的分离度为优化指标，最终确定如下所示的梯度条件：0 min，乙腈-0.2%磷酸水溶液（5%∶95%）；34 min，乙腈 -0.2%磷酸溶液（10%∶90%）；65 min，乙腈 -0.2%磷酸水溶液（25%∶75%）；79 min，乙腈-0.2%磷酸溶液（45%∶55%）；95 min，乙腈-0.2%磷酸水溶液（53%∶47%）；100 min，乙腈 -0.2%磷酸溶液（5%∶95%）。

2.6.3 检测波长选择 在 365 nm、300 nm、280 nm、260 nm、240 nm、210 nm波长下，按照2.1色谱条件进样分析，结果如图1。

图1 复方咳喘消颗粒指纹图谱波长选择

由图可见，240 nm下全方中的指纹峰的峰数和峰强度均优于其他波长，因此选择240 nm作为测定波长。

2.6.4 流动相选择 考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.15%磷酸、乙腈-0.2%磷酸、乙腈-0.3%磷酸对指纹图谱中色谱峰分离的影响，结果如图2。

图2 复方咳喘消颗粒指纹图谱流动相选择

由图可见，以乙腈-0.2%磷酸为流动相，几个关键色谱峰得以分离，峰形得到改善。结果还表明，0.2%和0.3%磷酸对图谱的影响不大，考虑到酸度较大，会影响色谱柱寿命，最终选用乙腈-0.2%磷酸溶液为流动相。

2.6.5 溶剂选择 分别以甲醇、无水乙醇、60%乙醇作为提取溶剂制备样品，考察对所得指纹图谱峰数及峰形的影响。结果显示：三者作为溶剂制备样品，对指纹图谱各峰的影响很小，故选择黏度最低的甲醇作为溶剂。

2.7 方法学考察

2.7.1 精密度试验 取供试品溶液（批号070815）连续进样6次，测得指纹图谱共有峰45个，各共有峰相对保留时间RSD＜1%，相对峰面积RSD＜3%。

2.7.2 重复性试验 取复方咳喘消颗粒（批号070815）各6份进行测定，分别进样，测得各共有峰相对保留时间RSD＜1%，相对峰面积RSD＜3%。

2.7.3 稳定性试验 取供试品溶液（批号070815）分别在0、6、12、24、36、48 h 进样，测得各共有峰相对保留时间RSD＜1%，相对峰面积RSD＜3%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.8 指纹图谱及技术参数

2.8.1 指纹图谱 采用“2.1测定条件”项下方法测定10批样品，得到指纹图谱，见图3。根据10批样品指纹图谱提供的各种相关参数，确认样品中所有化学成分的色谱峰在100 min内全部出完。

2.8.2 共有指纹峰的标定及其峰形与峰貌描述 比较上述各色谱峰，发现在240 nm检测波长下，有45个峰或峰组是共有的，确认为共有指纹峰。

图3 复方咳喘消颗粒HPLC指纹图谱

2.8.3 共有指纹峰相对保留时间及峰面积比值 在240 nm检测波长下，以峰面积较大、分离度好、保留时间近中间的18号峰为参照峰，以其保留时间和峰面积作为1，分别计算其他各共有指纹峰的相对保留时间和峰面积比值（峰面积比值计算时，仅限于峰面积占总峰面积大于2%者），得到样品的指纹图谱的相关技术参数，结果见表1。各特征指纹峰的相对峰面积、相对保留时间均具有较好的重现性，特征指纹峰的相对保留时间RSD＜1%，相对峰面积RSD＜3%。

2.8.4 相似度计算 使用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”，将1～10批次咳喘消颗粒图谱数据导入，经多点校正和数据匹配，以中位数法生成对照指纹图谱。10批复方咳喘消颗粒的相似度分别为0.992、0.973、0.969、0.972、0.984、0.984、0.981、0.985、0.973、0.990，具有较好的相关性，见图4。

表1 各共有峰的相关参数

2.9 指纹图谱少量色谱峰的指认

分别吸取一定量2.2制备的对照品溶液加入到样品溶液中，按照“2.1测定条件”项下方法测定指纹图谱，与未加对照品溶液的样品指纹图谱进行比较，通过色谱峰峰高或峰面积的增加，对指纹图谱共有化学成分进行确认，其中6号峰为秦皮甲素、10号峰为秦皮乙素、11号峰为绿原酸、37号峰为木兰脂素、39号峰为五味子醇甲。

图4 复方咳喘消颗粒指纹图谱相似度评价

2.10 指纹图谱共有指纹峰与相应提取部位指纹图谱的相关性

分别取2.4制备的水提（醇提）浸膏溶液（批号为061212、070402、070406、070410、070524、070629、070707、070729、070803、070815），按照“2.1 测定条件”项下方法测定，得各提取部位指纹图谱，并与样品指纹图谱进行比较，结果见图5、图6。

图6 复方咳喘消颗粒水提部位HPLC指纹图谱

由图可知，水提部位指纹峰多集中于指纹图谱0～80 min段，而醇提部位指纹峰多集中于指纹图谱80～100 min段，水提物质极性较大先出峰，且说明处方中水提物质比重较大。

2.11 指纹图谱共有指纹峰与处方药材相应部位指纹图谱的相关性

分别取2.5制备的药材溶液，按照“2.1测定条件”项下方法测定，得到处方中各药材指纹图谱。见图7。

将各药材图谱与样品指纹图谱进行比较，根据对各色谱峰的保留时间、峰形等的考察，对指纹图谱共有指纹峰与处方药材相应部位指纹图谱的相关性进行分析确认。结果见表2。

3 讨论

图7 复方咳喘消复方各药材HPLC指纹图谱

表2 指纹图谱共有色谱峰来源

3.1 复方咳喘消颗粒为复方制剂，成分较多，未对各色谱峰化学成分一一归属确认，仅给出6号峰（秦皮甲素）、10号峰（秦皮乙素）、11号峰（绿原酸）、37号峰（木兰脂素）、39号峰（五味子醇甲）的归属。

由归属分析可得出各色谱峰的药材来源，处方中十味药材均对复方有所贡献，并有一个色谱峰对应两种或者三种药材归属的情况。君药金银花对应13组色谱峰，辛夷对应14组色谱峰，亦说明君药在处方中比重较大，具备相应的物质基础。同时建立了颗粒醇提部位及水提部位的指纹图谱，也对中间提取物的质量起到一定控制作用[1]。

3.2 用于判断复方咳喘消颗粒质量稳定性时，一方面通过图谱的直观比较，能够反映出各共有峰的有无及大致比例，从而判断其质量一致性的情况；另一方面通过计算相对保留时间及相对峰面积，判断是否符合所建立的指纹图谱的技术参数[2-3]。另外可通过峰面积对各指标成分进行定量，同时，采用药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对样品数据进行处理，相关系数不得低于0.90，以此制定复方咳喘消颗粒真伪鉴别及质量评价的标准。

3.3 指纹图谱与中药有效成分的复杂性、不确知性，以及发挥作用时众多成分的协同性、多靶点性特点相吻合[4]。复方咳喘消颗粒的HPLC指纹图谱，可作为控制其质量的定性指标，为处方中各味药材发挥临床疗效提供一定的物质基础保障。

[1]王新宏,安睿.数字化色谱指纹图谱技术在双黄连制剂质量及药材鉴定中的应用[J].中草药,2002,33（2）：115-118.

[2]沙明,曹爱民.HPLC指纹图谱技术在中药新药质量控制的应用[J].中草药,2002,33(2):181-183.

[3]胡柳,栾连军.复方有效部位与组方药材指纹图谱色谱峰相关性研究[J].中国药学杂志,2004，39（12）：895-902.

[4]聂晶,田颂久,王国荣.中药指纹图谱的研究现状[J].中国中药杂志,2000,31(12):881-890.