高效液相色谱法检测水产品中的ATP关联化合物＊

刘亚,章超桦,陆子锋

1(水产品深加工广东普通高校重点实验室,广东湛江,524088)

2(广东海洋大学食品科技学院广东,湛江,524088)

高效液相色谱法检测水产品中的ATP关联化合物＊

刘亚1,2,章超桦1,2,陆子锋2

1(水产品深加工广东普通高校重点实验室,广东湛江,524088)

2(广东海洋大学食品科技学院广东,湛江,524088)

研究了利用高效液相色谱法对水产品中的ATP关联化合物进行检测,确定了缓冲液的最佳pH值、流速和浓度,并对方法的准确度、精确度和检测限进行了测定。实验结果显示:pH值6.5,流速0.70 mL/min时色谱峰的分离情况较好。7种ATP关联化合物含量在2～500μg/mL时,浓度与色谱峰面积呈良好的线性关系。本方法的相对标准偏差为0.08%～6.81%,加标平均回收率为98.11%～102.25%。方法检出限为52～53 ng/mL。

高效液相色谱,ATP关联化合物,测定

ATP关联化合物是由嘌呤碱基、嘧啶碱基、尼克酰胺等与糖磷酸酯组成的一类化合物,如鸟苷酸(GMP)、肌苷酸(IMP)、三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)、次黄嘌呤核苷(Hx)和次黄嘌呤(HxR)等。它们与水产原料的风味和新鲜度紧密相关[1]。如AMP有着压抑苦味的特性,能使食物产生理想的甜味和咸味,是贝肉中良好的风味增强剂。而与AMP所产生的鲜味相反,ATP降解的一种最终产物——次黄嘌呤会产生苦味[2]。肌苷酸(IMP)、鸟苷酸(G MP)是主要的呈味核苷酸,作为新型的食品添加剂,已逐渐广泛应用于食品调味中[3]。MP增加食品鲜味的能力比谷氨酸钠强40倍,它与味精合用具有协同作用,含2%～8%肌苷酸的味精通常称为强力味精[4]。

对ATP关联化合物的检测方法种类较多,而高效液相色谱法相对于化学滴定法、紫外比色法、液相色谱离子交换法等,具有前处理简单、干扰小、灵敏度高、分析快速的特点[5-7]。本研究对液相色谱检测条件中流动相的最佳pH值、浓度和流速等进行实验,并对方法的准确度和精确度进行了检验,建立了适合水产品中ATP关联化合物检测的HPLC方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料

马氏珠母贝肉,购于广东湛江东风市场,去壳,采肉,于-20℃冷藏备用。沙虫干和元贝干,均购于广东湛江沃尔玛超市。

1.1.2 试剂

肌苷酸、鸟苷酸、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤标准品:Sigma公司,含量≥99.0%;甲醇,色谱纯;磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、高氯酸、磷酸和氢氧化钾均为分析纯;6%高氯酸,于4℃冰箱冷藏备用;实验用水均为超纯水。

1.1.3 仪器与设备

LC-20AD高效液相色谱仪,日本SHIMADZU公司;COS MOS IL 5C18-MS-II型HPLC色谱柱,日本Nacalai Tesque公司;UV-2550型紫外分光光度计,日本SHIMADZU公司;HR 1727型搅拌机,珠海飞利浦家庭电器有限公司;HIMAC CR22GII型冷冻离心剂,日本H ITACH I公司;PHSJ-4A型pH计,上海精密科学仪器有限公司;SB-5200型超声波清洗器,上海新芝生物技术研究所;SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵,巩义市予华仪器有限公司;LD-100G-C型超纯水机,重庆利迪现代水技术设备有限公司,以及其他实验室常规仪器。

实验用玻璃仪器用超声波清洗器水浴振荡30 min,用自来水反复冲洗,再用超纯水淋洗3～4遍,晾干备用。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理[8-9]

精确称取样品(湿样5 g,干样1 g),加入30 mL 6%冷高氯酸,湿样匀浆,干样放入装有冷水的容器超声振荡5 min,4℃10000 r/min离心20 min,取上清液,用KOH调节pH值至6.5,沉淀重复提取一次,合并上清液。置于2℃冰箱静置30 min,取上清液用0.45μm微孔滤膜过滤,所得滤液用pH值6.5的高氯酸定容至100 mL。4℃保存备用。上机检测前用0.22μm的微孔滤膜过滤。

1.2.2 色谱条件[8]

流动 相:流 动 相 A(0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4);流动相B为V(0.05 mol/L KH2PO4-K2HPO4)∶V(甲醇)=9∶1,pH值均为6.5,均用0.45μm的微孔滤膜过滤。

洗脱条件:二元梯度洗脱,梯度洗脱程序为,1～14 min为流动相A洗脱,14～18 min时流动相B按直线斜率上升至25%,18～22 min时流动相B上升至90%,22～25 min时过渡到用100%流动相B进行洗脱,流速0.7 mL/min,进样量10μL,检测波长254 nm。

1.2.3 标准溶液的配制[8]

分别准确称取鸟苷酸、肌苷酸、三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、一磷酸腺苷、次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤标准品0.0050 g,用超纯水溶解并混合定容于50 mL容量瓶中,成为混合标准。上机前再用0.22μm的微孔滤膜过滤。

1.2.4 计算公式

式中:WS,标准样品核苷酸的实测含量,mg/kg;AS,标准峰的面积;A,样品峰的面积。

2 结果与分析

2.1 流动相pH值对ATP关联物标准的色谱分离情况的影响

在混合标准溶液中,各标准物之间的分离度可以作为分离效果优劣的判断,流动相pH值的变化直接影响分离效果。在使用同一色谱柱和磷酸盐浓度相同的流动相并采用同样的进样量情况下,配制pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.5、7.5的流动相,进行色谱分析。色谱图见图1。

当分离度为1.0时,分离程度可以达到98%,分离度为1.5时,分离程度可达99.7%,以分离度为1.5作为相邻2峰已完全分开的标志。5种pH值条件下7个峰的分离度结果见表1。

图1 不同流动相pH值对ATP关联化合物的色谱分离情况比较

表1 不同pH的流动相对ATP关联化合物分离效果的影响

由图1和表1可知,当pH值为5.5和7.5时,7个峰不能完全分离。当pH值分别为4.0、4.5、5.0、和6.5时,在pH值较低条件下,峰形较差;随着pH值增大,峰形明显变好。对比7个标准物的分离情况,当pH为6.5时,各个峰的分离状况良好,峰形较好,说明pH在6.5左右流动相拥有良好的洗脱能力,使7种化合物具有不同的极性,便于洗脱分离。

2.2 流动相磷酸盐浓度对ATP关联物标准的色谱分离情况的影响

分别配制0.01、0.02L、0.03、0.04L、0.05和0.06 mol/L的KH2PO4-K2HPO4缓冲液A和B,考察在不同磷酸盐浓度的情况下的洗脱情况。色谱图见图2。

由图2可知,流动相浓度在0.01～0.03 mol/L时,出峰时间相对较长,峰形较差,有的峰还有明显的拖尾现象;随着浓度的提高,在0.04～0.06 mol/L时,7种标准物可以得到较好的分离,出峰时间稳定,保留时间变短。这可能由于随磷酸盐浓度的增加,较高浓度的流动相掩蔽C18反相色谱柱硅羟基的二次作用而减少了拖尾。由于较高的磷酸盐缓冲液浓度对色谱柱有较大的伤害,因此本实验选用0.05 mol/L的缓冲液浓度作为流动相浓度。

图2 不同磷酸盐浓度对ATP关联物标准的色谱分离情况的比较

2.3 流动相不同流速对ATP关联物标准的色谱分离情况的影响

分别以0.3、0.5、0.7、0.9、1.1mL/min的流速进行分离,分离情况见图3。

图3 不同流速对ATP关联物标准的色谱分离情况比较

由图3可知,随着流速的增大,总体洗脱时间明显减少,但过快的流速会造成泵压增大。从出峰时间和峰形来看,选用0.7 ml/min的流速来进行洗脱,峰形较高较尖,泵压适宜,总体耗时在35 min之内。

图4为最优条件下ATP关联化合物的标准物质图谱。

图4 ATP关联化合物标准物质图谱

图4 为7种ATP关联化合物标准物质的高效液相色谱图,本色谱条件下在35 min之内7种化合物得到了有效分离,且重现性好。其出峰顺序以时间由快到慢分别为G MP,IMP,ATP,ADP,Hx,AMP,HxR。

2.4 标准曲线与检测限

将混和标准溶液分别配制成2、10、20、50、100、500μg/mL标液,进行标准曲线的测定,实验结果见表2。

表2 ATP关联化合物标准曲线方程和相关系数

由表2可知,在2～500μg/mL内,7种ATP关联化合物的浓度和面积均具有良好的线性关系。

检出限是3倍空白值的标准偏差相对应的质量或浓度。色谱仪的最低响应值S=3N,N为仪器的噪音水平,实验结果表明,在样品中被测组分峰高为基线噪音3倍时的检出限值见表3。

表3 检测方法的最低检测限 ng/mL

2.5 实验方法的精确度和准确度

取30、40、50、100μg/mL ATP关联化合物的标准溶液,每个浓度连续进样5次,测得精确度结果。

配制未知浓度的样品,以其作为1.0×使用液,分别取使用液5.0、7.0,加入10 mL容量瓶,用超纯水定容至10 mL,得到0.5×、0.7×和1.0×3个未知浓度的使用液;再分别取1.0×、0.7×、0.5×使用液5.0 mL,加入已知浓度的100μg/mL核苷酸混合标准液5.0 mL,混合均匀,超声波清洗机振荡5 min,用0.22μm微孔滤膜过滤,分别对3种未知浓度的使用液和已知浓度的标准液上机测试,测定准确度的结果。精确度和准确度结果见表4。

实验结果显示,5次平行测定值的相对标准偏差为0.08%～6.81%;加标回收率为98.11%～102.25%之间,其精确度和准确度测试均符合GB/T27404-2008标准[10]。

表4 实验方法的精确度和准确度结果

2.8 样品的测定结果

准确称取马氏珠母贝肉、沙虫干粉、元贝粉按照

1.2.1 方法处理,各种样品测试结果见表5。

表5 三种样品的色谱测试结果(n=2) mg/kg

ATP及其降解产物的含量主要取决于其降解途径和所处的降解阶段。海产动物ATP的降解有2条途径[1,11]:(1)ATP→ADP→AMP→AdR→HxR→Hx;(2)ATP→ADP→AMP→ IMP→HxR→Hx。若通过途径(1)降解则AMP容易积累,以途径(2)降解,则MP更容易积累。一般认为途径(1)为软体动物的核苷酸代谢途径,(2)为鱼类代谢途径。本研究在马氏珠母贝中检出较高含量的AMP和 IMP,说明马氏珠母贝中ATP的降解以途径(1)为主;同时也存在降解途径(2)。

鲜活质量指标K值是反映水产品初期鲜度变化以及与品质风味有关的生化质量指标。一般采用K值≤20%作为优良鲜度指标(日本用于生食鱼肉的质量标准),K值≤60%作为加工原料的鲜度标准[1]。测定其最终分解产物(次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤)所占总的ATP关连物的百分数即为鲜度指标K值,可用下式表示:

K值越高,说明样品的核苷酸鲜味成分越少,鲜度越差。按鲜度从优到劣排序,元贝(1%)>沙虫干(16%)>鲜马氏珠母贝肉(79%)。马氏珠母贝肉的鲜度较低,未达到作为加工原料的鲜度标准。

3 小结

选用ODS C18反相色 谱 柱,以 pH值 6.5、0.05mol/L的磷酸盐缓冲液作为流动相,在254nm波长下检测样品中核苷酸关联化合物的含量。该色谱分离条件分离7种ATP关联化合物约需35min左右、分离效果好。经过对该方法的精确度、回收率试验和样品实际含量测定,结果表明该方法重现性良好,精确度高,能符合不同含量样品的测定的要求。

[1]沈月新,章超桦,薛长湖,等.水产食品学[M].北京:中国农业出版社,2001:159-194.

[2]Bremner Olley J.Nucleotide catabolis m;Influence on the storage life of tropical species of fish from the North West ShelfAystralia[J].Food Science,1988(53):6-11.

[3]崔桂友.呈味核苷酸及其在食品调味中的应用[J].中国烹饪研究,1999(2):1-6.

[4]于信令.味精工业手册[M].北京:中国轻工业出版社,1995:556-558.

[5]吴钰珩,汤丽芬,谭炳炎,等.用反相高效液相色谱法测定小鼠心肌、骨骼肌中ATP、ADP、AMP的含量[J].分析测试学报,1999,18(4):54-57.

[6]孟宪清,李群伟,朱大岭,等.高效液相色谱测定组织中ATP、ADP、AMP含量的方法[J].哈尔滨医科大学学报,1995,29(6):490-495.

[7]李治洪,刘克江.高效液相色谱法测定ATP制剂含量[J].药物分析杂志,1997,17(4):245-248.

[8]HwangDeng-fwu,Chen Tai-yuan,Shiau Chyuan-yuan,et al.Seasonal variations of free amino acids and nucleotiderelated compounds in the muscle of cultured Taiwanese puffer Takifugu rubripes[J].Fisheries Science,2000,66:1123-1129.

[9]石建高,钟文珠.太平洋柔鱼中呈味物质的抽提方法比较[J].大连水产学院学报,2002,12(17):291-296.

[10]GB/T27404-2008.实验室质量控制规范.食品理化检验[S].

[11]杨文鸽,薛长湖,徐大伦,等.大黄鱼冰藏期间ATP关联物含量变化及其鲜度评价[J].农业工程学报,2007(6):217-222.

ABSTRACTIn this study,the detection method ofATP related compounds of fishery products by using HPLC was researched.The optimal conditions such as pH value,flow rate and concentration of mobile phase were deter mined.The accuracy,precision and limit of quantitation were surveyed and evaluated.The results showed thatwhen the pH value was at 6.5 and the flow rate 0.70 mL/min the seven chromatographic peakswerewell separated.When the concentration of sevenATP related compoundswere from 2μg/mL to 500μg/mL,the concentration of standard substance and peak area were kept good linear relationship.The RSD%is be tween 0.08%and 6.81%,the coefficient of recovery reached 98.11%～102.25%.The limitsof quantitationwere from 52ng/mL to 53ng/mL.According to the result thismethod was better to detecting the ATP related compounds of fishery products.

Key wordsHPLC,ATP related compounds,determination

Detection of ATP Related Compounds of Sea Food by HPLC

Liu Ya1,2,Zhang Chao-hua1,2,Lu Zi-feng2
1(Key Laboratory ofAquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes,Zhangjiang 5240088,China)
2(College of Food Science&Technology,GuangdongOcean University,Zhanjiang 524088,China)

在读博士(章超桦教授为通讯作者,E-mail:zhangch@gdou.edu.cn)。

＊农业部“948项目”(No.2006 G42);国家科技支撑计划(No.2007BAD29B00)

2010-02-23,改回日期:2010-05-05