HPLC法测定蚕桑资源中1-脱氧野尻霉素的含量

陈岩，王智勇，杨一坤（.哈尔滨医科大学第一附属医院药学部，哈尔滨市5000；.哈尔滨医科大学第二附属医院药学部，哈尔滨市 5000）

1-脱氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是天然存在的多羟基哌啶生物碱，化学名为（2R，3R，4R，5S）-2-（羟甲基）-3，4，5-三羟基哌啶。该化合物具有竞争性抑制α-葡萄糖苷酶的药理活性[1]，广泛存在于蚕沙、桑白皮、桑枝、桑叶、桑椹等蚕桑资源中，可以防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症，同时可以提高糖耐量，预防和治疗肥胖症和高甘油三酯血症，用于治疗因碳水化合物代谢紊乱而引起的疾病。此外，还具有体外抗乙型肝炎病毒的作用[2，3]。

由于DNJ的结构中缺少生色团，无紫外吸收，目前多采用气-质联用（GC-MS）、液-质联用（LC-MS）、高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）、高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法进行含量测定[4～7]，对检测仪器的要求高，给实际工作带来不便。本试验参考有关文献[4]进行改进，采用荧光试剂芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）柱前衍生、高效液相色谱-紫外检测器（HPLC-UV）测定蚕桑资源中DNJ的含量，国内尚未见同类报道。

1 材料

1.1 仪器

HPLC仪，包括510泵、717自动进样器、996二极管阵列检测器、柱温箱、Millennium 2010色谱工作站（美国Waters公司）；AG-245型电子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；H-26F型离心机（日本Kokusan公司）；XJD-B微型高速粉碎机（姜堰市银河仪器厂）；N-1000型旋转蒸发仪、FD-5N型冻干机（日本Eyela公司）；KQ-200KDB型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；EK-120A型电子分析天平（日本A&D Co.，LTD公司）。

1.2 试药

DNJ标准品（纯度＞99.2%）、荧光试剂FMOC-Cl均购自美国Sigma公司；蚕沙、桑白皮、桑叶均购自哈尔滨市老君堂药店，经沈阳药科大学孙启时教授鉴定均为真品；甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.1%冰醋酸水溶液（50∶50）；检测波长：265 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；进样量：25 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准品溶液：精密称取DNJ标准品1.0 mg，加水溶解并定容至10 mL，即得，备用。

2.2.2 药材提取液：参考有关文献[4]中药材提取液的制备方法。精密称取各药材粉末1.0 g，加25 mL 0.05 mol·L-1HCl超声波提取30 min，上清液转移至50 mL量瓶中，残渣加20 mL 0.05 mol·L-1HCl超声波提取30 min，合并上清液，加0.05 mol·L-1HCl定容，摇匀，得各药材提取液，备用。

2.3 柱前衍生化处理

2.3.1 衍生化反应原理[4]：20℃下，DNJ和过量的荧光试剂FMOC-Cl在pH 8.5的硼酸盐缓冲液中反应20 min，生成荧光产物DNJ-FMOC。

2.3.2 药材供试液的制备：精密吸取各药材提取液0.2 mL，置于1.5 mL离心管中，分别依次加入0.2 mL硼酸盐缓冲液（pH 8.5）、0.1 mL 10 mmol·L-1FMOC-Cl的乙腈溶液，立即混匀，20℃反应20 min，加入0.5 mL 0.1%冰醋酸水溶液，混匀，0.45µm微孔滤膜滤过，即得各药材供试液。

2.3.3 空白供试液的制备：取重蒸水0.2 mL，按“2.3.2”项下方法制备空白供试液。

2.4 线性关系考察

精密吸取DNJ标准品溶液5、10、25、50、100 µL，分别依次加入 0.2 mL硼酸盐缓冲液（pH 8.5）、0.1 mL 10 mmol·L-1FMOC-Cl的乙腈溶液，立即混匀，20℃反应20 min，加入0.1%冰醋酸水溶液补足至1.0 mL，混匀，0.45µm微孔滤膜滤过，按“2.1”项下色谱条件进行测定。以DNJ浓度（X，mg·mL-1）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，制备标准曲线，得回归方程为Y＝47 800 312X－6 875（r＝0.999 9）。结果表明，DNJ的检测浓度在5.0×10-4～1.0×10-3mg·mL-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。检测限为1.0×10-4mg·mL-1（P/N＞3）。

2.5 精密度试验

取衍生化的DNJ标准品溶液（浓度为5.0×10-3mg·mL-1），按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次。结果，RSD＝1.9%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取桑白皮药材供试液，于配制后2、4、6、8 h进样，按“2.1”项下色谱条件测定DNJ含量。结果，RSD＝1.8%，表明药材供试液在8 h内稳定。

2.7 重复性试验

精密称取同一批桑白皮样品，共6份，按“2.3.2”项下方法制备供试液，按“2.9”项下方法操作。结果，RSD＝1.67%，表明方法重复性良好。

2.8 加样回收率试验

精密称取已知含量的桑叶粉末0.5 g，共6份，分别精密加入DNJ标准品溶液，按“2.3.2”项下方法制备供试液，按“2.1”项下色谱条件依法测定，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.9 样品含量测定

取“2.3.2”项下各药材供试液，按“2.1”项下色谱条件测定DNJ含量，结果见表2；色谱图见图1。

3 讨论

通过二极管阵列检测器得到DNJ-FMOC的最大吸收波长为265 nm，因此确定检测波长为265 nm。在此波长下，DNJ-FMOC的灵敏度高，所得色谱图基线平稳。

表2 蚕桑资源中DNJ的含量测定结果（n＝3）Tab 2Determination of DNJ in mulberry resources（n＝3）

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogram

笔者考察了不同比例的乙腈-水、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液为流动相时DNJ-FMOC的分离效果，确定以乙腈-0.1%冰醋酸水溶液（50∶50）为流动相进行分析，DNJ-FMOC与衍生试剂FMOC-Cl及其它峰的分离度良好，峰形最佳。

DNJ无共轭体系，常用的检测方法中HPLC-ELSD灵敏度低，HPLC-FLD存在荧光强度受外界因素（温度、溶剂、pH值）影响大的问题，而GC-MS、LC-MS使用成本高，不能在一般实验室普及。本试验采用柱前衍生、HPLC-UV检测，方法具有对检测仪器要求低、操作简单快速、衍生产物稳定、测定结果准确等特点，可用于蚕桑资源中多羟基哌啶生物碱的定量分析，对蚕桑类中药材的综合质量评价具有重要的意义。

[1]孙 莲，孟 磊，阎 超.桑叶的降血糖活性成分和药理作用[J].中草药，2002，33（5）：471.

[2]孙 伟，李 静，李娅娟.慢性肝炎治疗药物研究新进展[J].中国药房，2002，13（5）：29.

[3]彭忠田，申 璀，谭德明，等.脱氧野尻霉素衍生物抗乙型肝炎病毒的体外试验研究[J].中国药房，2007，18（1）：9.

[4]Kim LW，Kim SU，Lee HS，et al.Determination of 1-deoxynojirimycin inMorus albaL.leaves by derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate followed by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，2003，1 002（1）：93.

[5]耿 鹏，朱元元，杨 洋，等.桑树资源中1-脱氧野尻霉素的测定及其生物活性成分分析[J].中草药，2005，36（8）：1 151.

[6]姜永涛，陈继永，刘 珂.HPLC-ELSD测定桑叶中1-脱氧野尻霉素的含量[J].药物分析杂志，2005，25（1）：27.

[7]Toshiyuki K，Kiyotaka N，Yuko S，et al.Determination of 1-deoxynojirimycin in mulberry leaves using hydrophilic interaction chromatography with evaporative light scattering detection[J].J Agric Food Chem，2004，52：1 415.