正交试验优选狗肝菜中多糖提取工艺Δ

张可锋，朱华，高雅，邹登峰（.桂林医学院，桂林市54004；.广西中医学院，南宁市53000）

狗肝菜为爵床科植物狗肝菜Dicliptera chinensis（L.）Nees的全草，其味苦、性寒，具有清热、凉血、利尿、解毒等功效，临床常用于治疗热病斑疹、便血、溺血、小便不利、肿毒疔疮等证。有文献报道，狗肝菜主要含有多糖、有机酸、氨基酸等物质[1]，其中多糖具有保肝降酶的活性[2]，但对狗肝菜多糖的提取工艺研究国内外尚未见报道。本研究采用单因素和L9（34）正交试验法考察提取时间、温度、次数和料液比对狗肝菜多糖得率的影响，以期为狗肝菜活性成分的进一步研究与资源应用提供理论依据。

1 仪器与试药

UV-2550紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）。狗肝菜药材采自广西中医学院药用植物园，经广西中医学院药用植物教研室韦松基教授鉴定为真品。葡萄糖（广东汕头市西陇化工厂，批号：0703151）；苯酚、硫酸、乙醇、石油醚（30～60℃）、丙酮、乙醚及其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 狗肝菜多糖的提取

称取干燥的狗肝菜全草粗粉100 g，加入适量石油醚脱脂，无水乙醇除杂，各回流提取2 h。药渣挥尽乙醇后沸水提取2次，每次1.5 h，合并提取液，浓缩至100 mL，氯仿-正丁醇（4∶1）多次萃取（即Sevag法），除去蛋白质，加95%乙醇使醇含量达到80%，于4℃冰箱中醇沉12 h。抽滤，滤渣依次用乙醚、无水乙醇、丙酮洗涤，即得狗肝菜多糖。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖250 mg，蒸馏水溶解后定容至100 mL。准确吸取此溶液1 mL，置于25 mL量瓶中 ，稀释至刻度，摇匀（含葡萄糖100 μg·mL-1），备用。

2.3 标准曲线的制备

分别准确吸取标准溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL，置于具塞试管中，用蒸馏水补充至2 mL，以蒸馏水作空白，每管加入5%苯酚溶液1 mL，再垂直快速加入浓硫酸5 mL，摇匀，放置10 min，沸水加热15 min，之后用流水速冷至室温，于487 nm波长处测定吸光度（A）。以检测浓度（C）为横坐标，A为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为A＝0.007 74C+0.036 38（r＝ 0.999 4）。结果表明，狗肝菜多糖检测浓度在20～70 μg·mL-1范围内与吸光度呈良好线性关系。

2.4 换算因子的测定

准确称取多糖20 mg，溶于100 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀。准确吸取此溶液1 mL，置于具塞试管中，按“2.3”项下方法测定吸光度，根据回归方程计算多糖溶液中葡萄糖的浓度，按下式计算出换算因子：f＝W/（C·D）。式中，W为多糖质量（mg）；C为多糖浓度（μg·mL-1）；D为稀释倍数。

2.5 供试品溶液的制备

准确称取生药狗肝菜1 g，以石油醚脱脂，水煎煮法提取，醇沉、减压干燥，按“2.9”项下方法提取操作。精密称定各提取物质量20 mg，然后加水定容至250 mL，作为样品溶液。

2.6 多糖含量的测定[3]

精密吸取供试品溶液2 mL，置于具塞试管中，按苯酚-浓硫酸法，照“2.3”项下方法测定吸光度，由回归方程计算供试品溶液中葡萄糖浓度，按公式：含量（%）＝（C∙D∙f/W）×100%，计算供试品中多糖的含量；多糖得率（%）＝多糖含量×干燥提取物质量（g）/原料质量（g）。其中，C为样品液中葡萄糖的浓度；D为稀释因素；f为换算因子；W为样品质量。

2.7 加样回收率试验

精密称取6份空白基质各5 g，分别加入精制多糖10 mg，按“2.5”项下供试品溶液的方法制备和“2.3”项方法操作测定，测定吸光度，计算加样回收率和RSD，结果分别为98.58%、2.19%。

2.8 精密度试验

取样品液2 mL，按“2.3”项方法测定5次，测定吸光度，结果RSD＝0.51%。

2.9 试验条件的优化

2.9.1 单因素分析试验 （1）提取时间对狗肝菜多糖得率的影响：以料液比1∶15、温度90℃，提取2次，用85%的乙醇沉淀，不同的提取时间（1、1.5、2.0、2.5 h）多糖得率分别为2.30%、2.62、2.86%、2.87%。可见提取2.0 h多糖得率相对较高，随着时间的延长，多糖得率不再增加，考虑其狗肝菜中多糖的含量是一定的，在其它条件不变下延长时间狗肝菜药材中一些其它的成分会被提取出来，干扰多糖的检测结果。（2）提取次数对狗肝菜多糖得率的影响：选择不同提取次数（1、2、3），以1∶15的料液比，在90℃下提取2.0 h，用85%的乙醇沉淀，多糖得率分别为2.70%、2.98%、3.01%。可见，提取3次多糖的得率相对较高，但提取2次和3次得率相差不多，从工艺及操作上考虑选择提取2次。（3）提取温度对多糖得率的影响：以料液比1∶15，提取2次，每次2.0 h，用85%的乙醇沉淀，不同的提取温度（80、85、90、95℃）多糖得率分别为2.80%、2.83%、2.85%、2.86%。可见提取温度90℃多糖得率相对较高，随着温度升高，多糖得率不再增加。（4）料液比对狗肝菜多糖得率的影响：选择不同的料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25），温度为 90 ℃，提取2次，每次2.0 h，用85%的乙醇沉淀，结果多糖得率分别为2.72%、2.81%、2.84%、2.86%。可见随着料液比增大，多糖得率不断增加，在料液比1∶20以上时，多糖得率增加缓慢。（5）醇沉浓度对狗肝菜多糖得率的影响：以1∶20的料液比，在90℃下提取2次，每次2 h，选择不同醇沉浓度（80%、85%、90%），结果多糖得率分别为3.08%、3.10%、3.10%。可见80%以上乙醇对狗肝菜多糖沉淀度影响不大。考虑节省原料，在工艺中选择80%的乙醇沉淀即可。

2.9.2 正交试验 通过对提取时间、温度、次数、料液比和醇沉浓度这5个因素进行分析，根据单因素分析结果，从中选取提取时间（A）、提取次数（B）、提取温度（C）、料液比（D）4个因素，采用L9（34）表进行正交试验，以狗肝菜多糖得率为指标确定最佳提取工艺。因素水平见表1；正交试验结果见表2；方差分析结果见表3。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交试验结果Tab 2 Results of orthogonal test

表3 方差分析结果Tab 3 Results of variance analysis

由表2、表3可知，影响因素的主次顺序为A＞D＞B＞C，C为非主要因素，考虑能源，选择提取温度为85℃，故狗肝菜多糖最佳提取工艺为A3B2C1D3，即提取时间2 h，提取2次，温度85 ℃，料液比1∶20。

2.9.3 验证试验 按正交试验的优化条件对3批狗肝菜药材进行提取工艺验证，结果多糖含量和得率的平均值分别为（5.12±0.11）%和（3.26±0.3）%。3次差异较小，工艺稳定。

3 讨论

本文测定多糖含量方法的原理是先用无水乙醇除去单糖、低聚糖及其它干扰性成分，再用水提醇沉法得到多糖。多糖在浓硫酸的作用下水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后和苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，该化合物颜色深浅与糖的浓度成正比。因狗肝菜采收产地、季节等因素，其多糖含量会有差异，但多糖含量可作为其质量控制的指标之一。此外，今后应加强以多糖为活性成分的药理实验研究。

由于多糖在空气中易氧化使颜色加深，故在过滤过程中分别依次用乙醚、无水乙醇、丙酮多次洗涤，消除了这种变化，而后真空干燥可得狗肝菜多糖。

[1]江苏新医学院.中药大辞典[M].上海：上海科学技术出版社，1977：1 424.

[2]李海燕，王旭深.狗肝菜多糖保肝作用研究[J].中药材，2006，29（8）：833.

[3]侯剑萍，王春霞.牛膝多糖的提取纯化工艺研究[J].中国药房，2008，19（36）：2 822.