冰醋酸对水溶性伊红Y染液的影响及应用比例

2019-11-23曹金雷

中国现代医生 2019年24期

曹金雷

[摘要] 目的探討水溶性伊红Y染液中未加入冰醋酸时和逐步加入冰醋酸后其染色能力的变化及在实际应用中应加入的合适比例使染液能达到最佳的染色效果。方法选取近期接收的标本，常规脱水包埋切片。在各组切片进行染色时，在水溶性伊红Y染液内逐步加入冰醋酸，并记录下各组切片染色时水溶性伊红Y染液内的冰醋酸的量，最后显微镜下观察各组切片的染色效果以明确目的。结果当水溶性伊红Y染液内未加入冰醋酸时其染色能力较差，切片不易染色。随着染液内加入的冰醋酸逐渐增多，染液的染色能力逐渐增强，切片内各物质染色越深。当染液内加入的冰醋酸比例约0.5%时，染液的染色效果最佳，细胞核与细胞浆的对比度较好，可符合诊断要求。加入过多冰醋酸后染液的染色能力过强，切片被伊红深染，细胞核也被染色而呈现紫色，对比度下降，从而影响诊断。结论冰醋酸可使水溶性伊红Y染液的染色能力增强。但加入过多的冰醋酸后水溶性伊红Y染液的染色能力过强，切片的整体染色效果反而下降。因此在实际应用中冰醋酸的量需控制在一定范围（约0.5%时）内，使染液的染色能力适中，使细胞质易被伊红染液染成不同色调的红色而细胞核不被染色，从而能形成鲜明对比，达到诊断要求。

[关键词] 冰醋酸;常规染色;水溶性伊红Y;Gill改良苏木素染液

[中图分类号] R361 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2019）24-0141-04

[Abstract] Objective To explore the dyeing ability of water-soluble eosin Y dyeing solution without adding glacial acetic acid and after gradually adding glacial acetic acid， and to explore the appropriate ratio should be added in practical application to achieve the best dyeing effect. Methods The recently received specimens were selected and the conventional dehydrated embedded sections were used. When staining each group of slices， the amount of glacial acetic acid was gradually added to the water-soluble eosin Y dye solution， and the amount of glacial acetic acid in the water-soluble eosin Y dyeing solution was recorded under the staining each group of slices. The staining effect of each group of slices was used for a clear purpose. Results When glacial acetic acid was not added to the water-soluble eosin Y dyeing solution， its dyeing ability was poor， and the slice was not easy to stain. As the glacial acetic acid added to the dyeing solution gradually increased， the dyeing ability of the dyeing solution gradually increased， and the dyeing of the substances in the slices was deeper. When the proportion of glacial acetic acid added to the dyeing solution was about 0.5%， the dyeing effect of the dyeing solution was the best， and the contrast between the nucleus and the cytoplasm was good， which could meet the diagnostic requirements. After adding too much glacial acetic acid， the staining ability of the dyeing solution was too strong， the slice was deeply stained with eosin， the nucleus was also stained to appear purple， and the contrast was decreased， thereby affecting the diagnosis. Conclusion Glacial acetic acid can enhance the dyeing ability of water-soluble eosin Y dyeing solution. However， the dyeing ability of the water-soluble eosin Y dye solution is too strong after adding too much glacial acetic acid， and the overall staining effect of the slice decreases. Therefore， in practical applications， the amount of glacial acetic acid needs to be controlled within a certain range （about 0.5%）， so that the dyeing ability of the dyeing solution is moderate， and the cytoplasm is easily dyed into red with different shades and the nucleus is not stained. This will create a sharp contrast and meet diagnostic requirements.

[Key words] Glacial acetic acid; Conventional dyeing; Water-soluble eosin Y; Gill modified hematoxylin dyeing solution

苏木精-伊红染色法是病理常规制片中最为重要的染色方法，其中苏木精染液将细胞核染成蓝色，而伊红染液的作用是显示出细胞浆、嗜酸性颗粒、肌纤维和胶原纤维等结缔组织的不同色调的红色，与细胞核的蓝色形成鲜明对比。随着现代化技术的发展，在日常病理技术工作中使用了大量的全自动标准化器械，但是全自动染色机在进行常规染色时仍会出现病理切片蓝红对比失调的现象，为能染出符合病理诊断对常规切片染色的要求[1]，除了要确保染色程序的正常及正确地使用各类试剂[2]，还需要配制出优良的苏木精染液和染色能力适中、染色效果稳定的伊红染液，才能使切片内的核浆染色分明，核浆形成鲜明的对比。在实际工作中要配制出染色能力适中、染色效果稳定的伊红染液也绝非易事，其中冰醋酸有着至关重要的影响，需加入适量的冰醋酸方能达到最佳的染色效果。在很多文献及书籍中对于水溶性伊红Y的配制方法中所提及的加入冰醋酸的量以每100 mL加入1滴计算[3]，对于配制大量染液时并未说明具体百分比。因此，使用此法配制出的伊红染液，每次所加入的冰醋酸的量不尽一致，不能保证每次所配制出的伊红染液的染色能力均相当。因此，为保证每次均能配制出染色性能稳定、能力适中的伊红染液，就需要摸索出冰醋酸对伊红染液染色能力的具体影响及加入最佳比例，在此以水溶性伊红Y染液为研究对象，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料

选择义乌市中心医院病理科近期接收的标本：要求使用中性甲醛液[4]固定，固定效果良好，并充分脱水的标本（为保证标本充分固定及脱水，标本大小以2 cm×1.5 cm×0.2 cm左右[5]为宜），包括子宫肌瘤2例、阑尾2例、肝脏2例及淋巴结组织2例。

1.2 试剂

中性甲醛液（义乌市中心医院制剂室，规格：10 L/桶），Gill改良苏木精染液[6]：苏木素2 g（国药集团化学试剂有限公司，执行标准：Q/CYDZ2483-2012，规格：10 g/瓶），无水乙醇250 mL（安特食品股份有限公司，执行标准：GB/T678-2002，规格：500 mL/瓶），硫酸铝钾17.6 g（广东西陇化工厂，执行标准：GB1275-94，规格：500 g/瓶），蒸馏水750 mL（义乌市中心医院制剂室，规格：50 L/桶），碘酸钠0.2 g（上海），冰醋酸20 mL（西陇化工股份有限公司，执行标准：GB/T676-2007，规格：500 mL/瓶）;水溶液性伊红Y染液：水溶性伊红Y 6 g（中杉金桥生物技术有限公司，批号：18919505，规格：10 g/瓶），80%酒精900 mL（自行配制），蒸馏水100 mL，冰醋酸若干;40%酒精（自行配制），75%酒精（自行配制），85%酒精（自行配制），95%酒精（嵊州市天马消毒剂厂，执行标准：Q/SY001-2008，规格：5000 mL/瓶），无水乙醇，二甲苯（上海联试化工试剂有限公司，执行标准：GB/T16494-1996，规格：500 mL/瓶），石蜡（福建启盛实验设备科技有限公司，规格：1000 g/袋）。

1.3 器械

LEICA ASP300S全自动脱水机，LEICA EG 1150H石蜡包埋机，LEICA EG 1150C冷冻台，LEICA RM2235石蜡切片机，YT-6C生物组织摊烤片机，LEICA AUTOSTAINER XL全自动切片染色机，LEICA CV5030全自动封片机，LEICA DMLB显微镜。

1.4 方法

所有的組织标本，全部由LEICA ASP300S全自动脱水机[7]脱水，使用LEICA EG 1150H石蜡包埋机[8]和LEICA EG 1150C冷冻台进行塑料包埋盒包埋[9]，使用LEICA RM2235石蜡切片机进行常规石蜡切片[10-11]，切片厚度为4 μm[12]，先在40%酒精里预展片[13]，后在49℃的水温中裱片[14]，连续切片10张，对切片依次进行数字编号（从1～10），立即放入65℃的烤箱内烤片半小时[15]，烤片使用的是YT-6C生物组织摊烤片机。为尽量减少人为因素对切片染色效果的影响，在整个切片染色过程中使用全自动染色机进行染色及全自动封片机封片[16]：使用LEICA AUTOSTAINER XL全自动切片染色机[17]对各组切片（同一个数字编号的切片为同一组）分别进行染色。在切片染色过程中使用相同的染色程序，不改变其他试剂的前提下，水溶性伊红Y染液内未加入冰醋酸时和逐渐加入冰醋酸后分别使用不同编号的一组切片进行染色，如水溶性伊红Y染液内未加入冰醋酸时，使用编号为1的一组切片进行染色;当向水溶性伊红Y染液内加入0.5 mL冰醋酸时，使用编号为2的一组切片进行染色，依次类推，直至完成所有的切片染色，每次添加冰醋酸时进行充分搅拌以保证混合均匀。水溶性伊红Y染液内加入越多的冰醋酸后使用编号越大的切片进行染色，并记录每组切片进行染色时水溶性伊红Y染液内冰醋酸的量。切片染色完成后立即使用LEICA CV5030全自动封片机[18]封片。最后在显微镜下观察各组切片的染色效果，以明确冰醋酸对水溶性伊红Y染液的染色能力的影响，最后选择出染色效果好，红蓝分明，颜色程度适中，核浆对比度最好的切片，查看编号对照伊红染液内所加入的冰醋酸的量，以明确冰醋酸对水溶性伊红Y染液的影响及最佳应用比例。

2 结果

2.1 水溶性伊红Y染液内未加入冰醋酸

在显微镜下观察所有制作完成的切片染色情况。可发现编号为1的同一组切片的伊红不易着色，染色效果差，即水溶性伊红Y染液中未加入冰醋酸时，水溶性伊红Y染液的染色能力较弱，切片不易被水溶性伊红Y染液所染色，伊红染色效果差颜色不鲜艳、色泽淡与细胞核的蓝色对比度不明显（封三图5）。

2.2 水溶性伊红Y染液内逐渐加入冰醋酸

切片的编号逐渐增大，切片内的伊红染色效果逐渐加深，即随着水溶性伊红Y染液中的冰醋酸逐渐增多，水溶性伊红Y染液的染色能力逐渐增强。经过仔细对比各组切片的染色结果及参照文献的伊红染色标准[19]后，确定编号为4的切片内的伊红染色程度适中，染色效果好，可使切片内的细胞浆、嗜酸性颗粒、肌纤维和胶原纤维等结缔组织的不同色调的红色，与细胞核的蓝色形成较为鲜明对比，可符合病理诊断对切片染色的要求（封三图6）。

2.3 水溶性伊红Y染液内加入过多冰醋酸

编号过大的切片内伊红染色过深，即水溶性伊红Y染液内加入过多的冰醋酸后，使伊红染液的染色能力过强，切片内各物质均被水溶性伊红Y染液深染，出现颜色较均匀一的深红色，且出现核浆共染现象，使细胞核也被水溶性伊红Y染液所染色，致细胞核原已被苏木素染液染成的蓝色与伊红的红色重叠，使细胞核呈现紫色，反而使细胞核与细胞浆的对比度下降，不能符合病理诊断的要求，影响诊断（封三图7）。

3 讨论

病理科诊断医师在进行常规病理诊断时先通过显微镜直接观察组织切片内各细胞的形态和各成分的染色情况来初步诊断病理结果及判断是否需要进一步免疫组织化学检查或分子病理检查等。目前在病理科常规病理制片染色过程中仍以经典的苏木素-伊红染色法为主，也是病理技术员在日常工作中所必须熟练掌握并努力做好的一种染色方法[20]。为保证制作一张能符合诊断要求的病理切片，除了要有良好的固定和彻底的脱水外，切片的染色效果也是非常重要的，只有保证各类标准化器械内使用的试剂状态良好和器械运行程序的正确使用，才可使器械所处理的标本达到制作要求，其中最重要的是配制出染色效果好、染色性能稳定的苏木素染液和伊红染液。

苏木素是一种纯天然染料，是从苏木素树提炼出来的，苏木素树主产墨西哥的坎佩切，苏木素染色性能差，经过一百多年精心加工配制，现在的苏木素配方，染色性能好，保持时间长，是世界上唯一的常规细胞核染料，在水中可解离成带正电荷的碱性染料。细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性[21]，很容易与带正电荷的苏木素碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。苏木素染色完成后需要使用弱碱性溶液进行蓝化处理，因为苏木素在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。伊红是一种人工合成的化学试剂，是由醌式苯环结构的发色基团和卤素原子溴及钠盐的助色基团所组成的酸性染料，在水中离解成带负电荷阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，能与蓝色的细胞核形成鲜明对比，以达到病理诊断对常规切片染色的要求。

从实验结果中可以发现冰醋酸对水溶性伊红Y染液的染色能力有着至关重要的影响，因为细胞浆的主要化学成分是蛋白质，其次是核糖核酸（RNA）和脂蛋白质，大多为两性化合物，细胞浆的等电点pH为4.7～5.0。细胞浆是呈现酸式电离还是呈现碱式电离受溶液pH值的影响，而冰醋酸是一种酸性液体，加入水溶性伊红Y染液后可降低溶液的pH值。如封三图5当伊红染液中未加入冰醋酸时，其溶液pH值大于细胞质等电点，抑制了细胞质的碱式电离，表现酸式电离，从而成为带负电荷的阴离子，不易被水溶性伊红Y这一类酸性染料染色，因此切片染色效果不理想，颜色不鲜艳、色泽淡，切片内成分层次不清楚，不能与细胞核的蓝色形成鲜明对比，不符合常规切片染色的要求。结合实验结果可以发现向水溶性伊红Y染液内逐渐加入冰醋酸后，其染液的pH值逐渐减低，水溶性伊红Y染液的染色能力逐渐增强，使切片内的染色程度越来越深（切片更紅），与细胞核的蓝色对比度逐渐增强。当水溶性伊红Y染液中加入适量的冰醋酸时，使水溶性伊红Y染液的pH值低于细胞质等电点，此时细胞质表现为碱式电离，成为带正电荷的阳离子，易被带负电荷的酸性伊红染料染色，而染液的pH值仍高于染色体等电点，细胞核仍表现为酸式电离，成为带负电荷的阴离子，不易被水溶性伊红Y染色，不使细胞核染色。封三图6中水溶性伊红Y染液中加入约0.5%的冰醋酸，其溶液pH值正位于此区间内（低于细胞质等电点而高于细胞核等电点），可使细胞浆内的物质被伊红染成不同色调的红色，层次分明，而细胞核不被伊红染色，保持原有的蓝色，细胞浆和其他组织成分呈现出深浅不一的红色与细胞核的蓝色形成较为鲜明的对比，可符合诊断对常规切片的染色标准，易于诊断。封三图7时水溶性伊红Y染液内加入过多冰醋酸时，水溶性伊红Y染液的染色能力过强，使切片内的各物质被染的过深过浓而呈现较均一的深红色;且此时水溶性伊红Y染液的pH值低于染色体的等电点，使染色体也呈现为碱式电离，成为带正电荷的阳离子，易被水溶性伊红Y这一类带负电的酸性染料染色，使伊红的红色与细胞核原有的蓝色发生重叠现象而呈现紫色。切片内出现核浆共染现象后反而使核浆的对比度下降，影响诊断，且过深的染色使得病理医生在进行常规阅片时容易产生视觉疲劳，不利于长时间工作。

综上，向水溶性伊红Y染液中加入冰醋酸后可使染液内的pH值降低，水溶性伊红Y染液对切片的染色能力增强，冰醋酸的量越多，染色能力越强。当在水溶性伊红Y染液内加入0.5%的冰醋酸时，染液的染色能力适中，染色效果最好，使切片内各物质呈现不同色调的红色与细胞核的蓝色形成鲜明对比，可符合诊断对常规切片染色的要求。

[参考文献]

[1] 李志娟，王欣. 优级苏木精-伊红切片的质量要求[J]. 淮海医药，2008，26（6）：535.

[2] 黄泳军，骆新兰，朱小兰，等. 全自动染色机脱水、透明试剂量与效果的分析[J]. 诊断病理学杂志，2018，25（9）：662-663.

[3] 王伯沄，李玉松，黄高昇，等. 病理学技术[M]. 北京：人民卫生出版社，2000：133.

[4] 王友芳，林媛，饶万新，等. 4%中性甲醛固定液制备及质量评价[J]. 海峡药学，2013，25（7）：24-25.

[5] 王晓鸿，曹婉维. 制作优质HE病理组织切片的要素[J].中国实用医药，2011，6（6）：135-136.

[6] 赵红艳. 改良的苏木素-伊红染液配制法及应用[J]. 西北国防医学杂志，2003，24（1）：24.

[7] 廖首生，李里香. LEICA300S生物组织脱水机试剂更换时间的探讨[J].实验与检验医学，2009，27（3）：264-265.

[8] 李彦群，杨会钗，王珩，等. LEICA自动包埋机使用技巧[J]. 世界感染杂志，2003，3（1）：37.

[9] 彭云吉，黃孙裕，张静，等. 塑料包埋盒包埋与传统石蜡包埋框包埋方法对比研究[J]. 中外医学研究，2011， 9（22）：184-185.

[10] 杨晰朦，赵素玲. 病理组织石蜡切片制作体会及常见问题分析[J]. 医药卫生，2017，2（5）：234.

[11] 冯晨，徐康宁. 石蜡切片机巧用的方法及体会[J]. 新疆医学，2012，42（9）：107-108.