超声波萃取法提取恰玛古中类黄酮的工艺研究

马 菁，幸让新，王华强，程卫东

（1.石河子大学食品学院，石河子832003；2.天康生物添加剂分公司，新疆830013；3.神内食品有限公司，石河子832003）

恰玛古或恰麻古，学名芜菁，又叫蔓菁、圆根、盘菜等，二年生草本植物，是新疆维吾尔族人民众所周知的植物药材之一。据检测数据表明，恰玛古中含亚油酸、类黄酮、皂苷等多种营养成分和维生素B1、B2、C、PP及钙、铁等有效元素，还富含大量氨基酸。

类黄酮化合物是植物中重要的次生代谢产物之一,具有吸收紫外线、抗癌、抗氧化、增加免疫力等多种功效,应用前景广泛,已成为近年来研究的热点。许多类黄酮物质已在食品工业、医疗保健、化妆品等行业得到广泛应用[1，2]。食品工业中,类黄酮化合物不仅可作甜味剂、风味剂、增色剂、抗氧化剂,还是一类具有开发潜力的功能性食品[3，4]。由于超声波产生的强烈振动、较快的加速度、强烈的空化效应、搅拌作用等,可使植物材料中的有效成分迅速进入溶剂,从而增加有效成分的提取率,缩短超声时间,并且还可避免高温对提取成分的影响。因此，笔者对用超声波萃取[5，6]恰玛古中类黄酮物质的工艺进行了研究，以确定提取溶剂的浓度、液料比、超声波功率、时间等的最佳参数，为恰玛古资源的充分开发利用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

恰玛古由新疆南疆阿克苏市提供，80℃恒温干燥后粉碎过60目筛备用；芦丁标准品由中国药品生物制品检定所提供；无水乙醇由洛阳市化学试剂厂生产；NaOH由北京化工厂生产；硝酸铝由天津市福晨化学试剂厂生产；亚硝酸钠由上海试剂一厂生产。以上试剂均为分析纯。

UV-1240型分光光度计，由岛津（日本）仪器有限公司提供；搅拌超声波萃取仪，由上海新拓超声波溶样测试技术有限公司提供；电子天平由北京赛多利斯仪器系统有限公司提供。

1.2 试验方法

1.2.1 影响提取工艺效果的因素试验 （1）单因素试验 称取1g恰玛古粉末,置于50 mL圆底烧瓶中,在不同条件下提取,以确定提取因素变化范围以及各因素的较佳值。每次提取液过滤,用相应浓度的乙醇定容并测定提取液中类黄酮的含量。（2）响应面分析试验 以乙醇浓度、液料比、超声波功率和超声时间等因素作为考察研究对象，采用中心组合试验,以获取最佳工艺参数。

1.2.2 恰玛古类黄酮含量的测定[10，11]（1）芦丁标准曲线的绘制 精密称取经120℃恒温干燥至恒重，并于干燥器内冷却至室温的芦丁标准品20.0 mg置于200 mL容量瓶中，加少量30%乙醇水溶液，水浴微热使其溶解，冷却至室温，再用30%乙醇定容至刻度，摇匀，配成浓度为0.1 mg/L的芦丁标准溶液，备用。精密吸取标准芦丁溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置于10 mL容量瓶中，每个容量瓶中分别相当含有芦丁 0.0、0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mg，然后分别加入30%乙醇水溶液至5 mL，摇匀后，各加5%亚硝酸钠水溶液0.3 mL，摇匀，静置5 min，再加10%硝酸铝水溶液0.3 mL，摇匀后，静置6 min。最后加入4%Na0H溶液4.0 mL，摇匀，并用30%乙醇水溶液定容至刻度。放置15 min后，以第一管试剂溶液作空白对照，用722分光光度计在λ 500 nm处测吸光度,绘制标准曲线，浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，如图1所示。根据测定结果计算得出标准曲线方程：C=1.265 2A+0.004 8（R2=0.999 8）。（2）样品的测定精确称取恰玛古粉末1 g于50 mL容量瓶中,在不同条件下进行超声波辅助提取,提取液经离心过滤后,用相同浓度的乙醇溶液定容至50 mL。准确吸取1 mL恰玛古提取液于10 mL容量瓶中,按照绘制标准曲线的方法,置于比色皿中,在波长500 nm处测定吸光度,由标准曲线方程计算得出样品溶液质量浓度C,再计算出样品中类黄酮含量,计算公式为:

其中:C为样液中类黄酮的浓度(单位：mg/mL)；V为样液的稀释体积（单位：mL）；M为样品质量（单位：g）。

2 结果与分析

2.1 响应面分析法优化试验

2.1.1 响应面分析法单因素试验设计 在单因素试验的基础上，为提高试验结果的可靠性，应用响应面分析法，采用四因素三水平的旋转组合设计，以类黄酮含量为响应值，确定超声波萃取类黄酮的最佳工艺参数，如表1所示。

根据相应的设计试验方案进行试验后，对试验数据进行二次回归拟合,得到适宜的回归方程,对此方程所代表的面进行分析，推测最佳条件在试验中所覆盖的区域，或判断试验的最佳途径。试验设计与统计分析软件采用Design Expert 7.1.3。

2.2.2 响应面分析法正交试验 按照中心组合设计试验方案进行四因素三水平试验，试验结果参见表2。

将所得的试验数据采用Design Expert 7.1.3软件进行多元回归拟合，得到以类黄酮含量为目标函数的二次回归方程：

回归方程的方差分析结果如表3所示。

表3 回归方程的方差分析

由表3可知,模型(p值为0.000 1)是非常显著的，模型失拟项(Lack of fit)表示模型预测值与实际值不拟合的概率。而失拟项p值为0.1069，大于0.05，模型失拟项不显著,模型选择合适。回归系数R2=0.971 7，大于0.9，说明模型相关度很好。因此，可以使用该模型来分析响应值的变化。

通过Design Expert 7.1.3软件绘制可视化响应面分析曲线图，调查相关变量间的交互作用以及确定最优点，图1～6是以类黄酮含量为响应值的趋势图，其等高线图可直观反映出两变量交互作用的显著程度，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形与之相反。

图1 乙醇浓度与液料比交互影响类黄酮含量的曲面图和等高线图

图2 乙醇浓度与超声波功率交互影响类黄酮含量的曲面图和等高线图

图3 乙醇浓度与超声时间交互影响类黄酮含量的曲面图和等高线图

图4 液料比与超声波功率交互影响类黄酮含量的曲面图和等高线图

图5 液料比与超声时间交互影响类黄酮含量的曲面图和等高线图

图6 超声波功率与超声时间交互影响类黄酮含量的曲面图和等高线图

由等高线图和方差分析结果得出，图2、5等高线呈圆形，交互作用不显著；图1、3、4、6中等高线均呈椭圆形,表明两因素交互作用均显著。由图1～6响应面立体图可知,响应值存在最大值,经软件分析计算,得到类黄酮含量预测值最大时的工艺条件：乙醇浓度为51.73%，液料比41.50∶1，超声波功率438.00 W，萃取时间55.54 min，预测值为0.536 5 g/100 g。在优化条件下，考虑到实际操作的方便，将超声波萃取恰玛古中类黄酮最佳工艺修正为乙醇浓度52%，液料比41∶1，超声波功率438 W，萃取时间55 min。对试验结果进行5次验证试验，结果表明，类黄酮的提取含量为0.509 6 g/100 g，与理论预测值基本吻合。

3 结 论

通过采用中心组合设计试验和响应面试验分析，得到乙醇浓度、液料比、超声波功率和超声时间4因素对恰玛古中类黄酮提取含量的影响结果。恰玛古中类黄酮超声波提取工艺参数的回归方程为:Y=0.500+0.026X1+0.042 X2+0.032 X3+0.046 X4+0.042 X1X2+0.001X1X3+0.032 X1X4+0.024 X2X3+0.011 X2X4+0.023 X3X4－0.075－0.082－0.069－0.058。方差分析结果表明，拟合检验极显著,决定系数达0.971 7，该方程能较好地预测恰玛古中类黄酮提取含量随各参数变化的规律。超声波萃取法提取恰玛古类黄酮的最佳工艺条件为：乙醇浓度52%，液料比41∶1，超声波功率438 W，超声时间55 min，类黄酮提取含量为0.509 6 g/100 g。

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