ε-聚赖氨酸在食品中应用的研究进展

李昆仑 ，李江阔 ，张 鹏 ，张 平

（1.国家农产品保鲜工程技术研究中心（天津）天津市农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室，天津 300384；2.沈阳农业大学食品学院，沈阳 110161）

目前，在食品添加剂市场上使用的防腐剂种类很多，但大部分是人工合成防腐剂。因此类防腐剂受pH影响，只有在酸性条件下才能发挥作用，如山梨酸及其钾盐，苯甲酸及其钠盐等，均属化学防腐剂，对人体有一定的毒副作用。而占比重很小的天然防腐剂又存在着抗菌谱窄、效率低、防腐作用不明显等弊端。因此，研发抗菌谱广、抗菌性强、安全无毒、受pH影响小的天然食品防腐剂已经成为世界各国食品科技工作者的研究重点。

1977年，S Shima和H Sakai从土壤中分离出可以产生ε-聚赖氨酸（ε-PL）的Streptomyces albulus346，1982年又证实这种聚合物是由L-赖氨酸组成。聚赖氨酸是赖氨酸α位的羰基和β位氨基结合的聚合物。后来ε-聚赖氨酸(ε-PL)被证实有广谱抗菌性，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌均有抑制作用，对细菌的最小抑制浓度（MIC）小于100 μg/mL，对真菌的抑制浓度略高，并且在高温、酸、碱条件下都稳定存在。ε-PL作为新型天然防腐剂，已于2003年10月被FDA批准为安全食品添加剂，在日本已实现工业化生产，并进入了市场。但是在我国ε-PL还处于试验研究阶段，有待于进一步研究与探索。

1 ε-PL理化性质

1.1 化学结构

由S.albulus生产的ε-PL由25～35个L-赖氨酸残基组成，除了长度以外，没有明确的研究结果表明ε-PL有二级或者三级结构。其分子结构如下：

1.2 最适pH值

ε-PL为淡黄色粉末，吸湿性强，略有苦味，最适pH值为5～8。也就是说，ε-PL在中性或微酸、微碱性环境中有较强的抑菌性，而在酸性和碱性条件下，抑菌效果不太理想。这可能是由于聚赖氨酸作为赖氨酸的聚合物在酸性和碱性条件下易分解的缘故。

1.3 热稳定性

ε-PL热稳定性非常好，即使将其水溶液加热至100℃处理30 min或120℃处理20 min后，也不会发生分解现象，仍保持原有聚合物的长度。J Hiraki（2000）研究表明，在pH值3.0时加热，ε-PL的结构也未发生变化。ε-PL能够承受一般食品加工过程中的加热处理，可以随原料一同进行灭菌处理，防止二次污染。

1.4 胶体性质

ε-PL作为一种浓缩胶质溶液的交联剂，它的效力对pH值和胶质分布有依赖性。在胶质中，阳离子电荷与阴离子缩氨酸聚合物的平衡导致了胶体的不透明性和最终网络结构的崩溃[1]。

在pH值接近中性时，L-聚赖氨酸可以作为一种有效的胶质网络交联剂。一种甲基酯化程度为36%的胶质形成了一种透明的弹性凝胶体，胶质中的电荷重新分配。凝胶体的硬度随着交联剂的浓度增加而增加，在ε-PL胶质所占比率为0.21～0.56时达到最大值。聚阳离子赖氨酸的添加会导致凝胶体透明度的下降，并且最终导致网状结构的崩溃。胶质聚赖氨酸链的亲和力随着聚赖氨酸链长的不断增长而增加，聚赖氨酸残基达到47个时，交互作用的稳定性常数是8700。作为一种交联剂，聚赖氨酸的存在降低了Donnan效果的影响程度，导致了网状物的融胀。在复杂的非原质体环境中，离子影响着全部平衡，包括无机的和有机的阳离子，可以通过对网络交联和融胀的影响调整胶质网络的性质[1]。

2 ε-PL抑菌性

J Hiraki等指出，ε-PL的抑菌机理可能是因为它是阳离子表面活性物质，能破坏微生物的细胞膜结构，引起细胞的物质、能量和信息传递中断，还能与细胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成，最终导致细胞死亡。ε-PL对细菌、真菌、酵母的最低抑制浓度不同，原因可能是它们的细胞表面结构不同。ε-PL既可以抑制革兰氏阳性菌生长，又可以抑制革兰氏阴性菌生长，除了乳链球菌和空肠弯曲菌（150 μg/mL）外，对其他细菌的最小抑制浓度均不超过50 μg/mL。在对酵母的抑制作用中，对毕赤酵母、接合酵母的最小抑制浓度是150 μg/mL,对假丝酵母、法夫酵母、子囊菌、乳糖分解酵素红酵母、掷孢酵母、啤酒酵母等其他酵母的抑制作用都不超过50 μg/mL。而对霉菌的最小抑制浓度均超过50 μg/mL[2]。

S Shima等采用Escherichia coli K-12研究了ε-PL的分子量与抑菌性关系的结果表明，超过9个L-赖氨酸残基才可以抑制微生物的生长，而化学改性α氨基会降低抑菌活性[3]。ε-PL是一种阳离子聚合物，等电点是9.0。因此，在碱性条件下，抑菌活性和抗噬菌体的活性最低。对于E.coli，在pH值为5.0～8.0条件下，最低抑制浓度是25～50 μg/mL，而在pH值为8.0时最低抑制浓度大于200 μg/mL[2]。同样，如果存在像偏磷酸这种阴离子聚合物的情况下也会降低ε-PL的抑菌活性，其原因是降低了它的阳离子电荷。

3 ε-PL抗菌特性

ε-PL具有广谱抑菌性，对革兰氏阳性和阴性菌如大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌、乳酸菌、金黄色葡萄球菌等的繁殖有抑制作用，而对霉菌的抑制作用较小。ε-PL作为保鲜剂具有安全性能高、在水中的溶解性强、热稳定性好、使用范围广以及不影响食品风味等优点，在中性和微酸性环境条件下均有较强的抑菌作用。由于对热稳定，加入后可热处理，因此还能抑制耐热性芽孢杆菌等。另外，S Shima等认为，ε-PL对一些呈蝌蚪状的非收缩性长尾噬菌体也有抑制作用[3]。值得注意的是,具有高抑菌活性的ε-PL至少必须有10个以上赖氨酸单体，而且利用微生物合成的ε-PL抗菌活性高于化学合成的α-聚赖氨酸（含有50个赖氨酸单体）。

3.1 抗菌谱

为了调查ε-PL对不同微生物培养过程中生长的抑制情况，J Hiraki等根据不同微生物的营养需求，采用相应的培养基和培养条件培养不同的微生物，并在培养基中加入不同浓度的ε-PL，以观察ε-PL对不同微生物生长的最小抑菌浓度（MIC），调查结果参见表1[2]。

表1 ε-PL抑制微生物生长的最小抑菌浓度

由表1可以看出，ε-PL具有广谱抗菌性，对细菌的最小抑菌浓度（MIC）均小于100 μg/mL，而对真菌的MIC相对要高一些。

3.2 安全性

ε-PL在日本作为东方式食品的保鲜剂已有很长一段时间，如在生鱼片和生鱼寿司中一般添加量为1000～5000 μg/g，在米饭（快餐盒）、面汤和其它汤类、面条、煮熟蔬菜等的添加量为10～500 μg/g。A Fukutome等[4]进行的慢性毒性和致癌性联合试验结果表明，每天摄取的食物中ε-PL含量在6500 μg/g属于极安全的水平；在ε-PL添加量为20000 μg/g时，无明显的组织病理变化,也观察不到可能的致癌性。J Hiraki等用非常详细的毒理试验证实了ε-PL作为食品保鲜剂的高度安全性[5]，他们用雄性或雌性老鼠进行急性毒性试验，试验分两组，均用ε-PL连续喂养14天，一组喂养量为每天 5 g/kg（ε-PL 质量/老鼠体重），5 min后，所有老鼠的情绪只受到轻微的影响，3～6 h后恢复正常；而喂养量为每天1.25～2.5 g/kg的另一组老鼠，则观察不到任何毒性反应，两组老鼠的体重也没有任何差别，表明ε-PL对老鼠生长没有任何影响。急性毒性试验后又进一步观察了很长一段时间发现，所有老鼠的体重均没有受到影响，主要器官的病理检查也没有任何异常。用代谢活力缺陷的鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）等细菌进行回复试验也表明ε-PL没有致突变性。90天喂养慢性毒理试验（Subchronic toxicity）表明，每天摄取的食物中ε-PL含量在10000 μg/g以下属于极安全的水平。用14C标志的ε-PL进行ADME试验(动物的吸收性、分布性、代谢性和排泄性试验)也表明ε-PL的安全性。ε-PL作为食品保鲜剂在米饭或寿司中添加量为5～50 μg/g,以每人每天进食 300 g米饭(加有 50 μg/g 的 ε-PL)，一个 60 kg 体重的人每天进食的ε-PL量只有15 mg，因此ε-PL作为食品保鲜剂是极安全的。

3.3 使用范围

ε-PL具有水溶性好、热稳定性和pH使用范围广等特点，在各种不同条件下均可使用。ε-PL的主要生产商日本窒素公司（Chisso Corporation）对产品的热稳定性和pH值使用范围等进行了试验，试验结果参见表2和表3。

表2 热处理对ε－PL MIC的影响

表3 pH值对ε－PL MIC的影响

从表2和表3可以看出，ε－PL具有很好的热稳定性，能够承受一般食品加工过程中的热处理，可以随原料一同进行灭菌处理，防止二次污染，而在pH值5～8范围内抑菌效果相对比较稳定。

3.4 对食品风味的影响

ε－PL作为食品保鲜剂不影响食品风味，Ho Yu－Ting等研究发现，由于耐热性好，ε－PL加入食品中经过高温消毒能与右旋糖苷发生美拉德反应，且不仅能够保持抗菌效力，还有很强的乳化特性，甚至食品在pH值7和1 mol/L NaCl的环境下，这种乳化特性也不受影响，因此证明ε－PL是具有乳化和防腐双重功能的食品添加剂[6]。

3.5 抑菌机理

ε－PL呈高聚合多价阳离子态，它能破坏微生物的细胞膜结构[7]，引起细胞的物质、能量和信息传递中断，还能与胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成，最终导致微生物细胞死亡。

4 ε－PL在食品加工中的应用

4.1 食品防腐剂

在工业及食物产品中广泛应用的化学防腐剂会危害到人体的健康，因此，研究开发新型天然防腐剂是人类对食品安全的需要。J Hiraki等[8]和S Shima等[3]都发现ε－PL具有很好的抗菌活性和热稳定性，所以是一种理想的天然食品防腐剂。同时K Neda（1999）对ε－PL进行了毒理学研究，经慢性和亚急性喂饲小鼠实验证明了ε－PL没有毒性，甚至当ε－PL高达20000 mg/kg剂量水平的时候也不会产生任何的不良效果或基因突变。此外，ε－PL对生殖系统、神经系统、免疫系统，胚胎的发育、后代的生长，甚至第二代的胚胎发育都不会产生毒性，因此认为是一种安全的天然防腐剂。J Hiraki等[9]通过14C－放射法研究ε－PL在体内的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）后发现，ε－PL 在胃肠道中几乎不被吸收，168 h之内经过排泄放射性也随之消减。另外，对受体进行X光照射检查，在任何组织器官内未发现ε－PL的堆积。

基于ADME及毒理学上的研究，在日本ε－PL已经作为多种食品的防腐剂被广泛使用。例如，在日本传统的日常菜肴中（500 mg/kg），在加工天然食品如生鱼片、寿司中（1000～5000 mg/kg），方便食品如方便米饭、方便面、速食汤、速食蔬菜（10～500 mg/kg），以及在蛋糕、色拉、乳酪等中的应用。近年来，美国也开始使用ε－PL，主要作为防腐剂应用于方便食品中，添加浓度为 5～50 mg/kg。

ε－PL作为一种新型食品防腐剂除了单独使用外，还可以与其它食品添加剂混合使用，如氨基乙酸、醋、乙醇、维他命等，并且混合使用后可以明显地提高ε－PL的防腐能力。例如当ε－PL和氨基乙酸混合用于浓缩牛奶的防腐时，会产生明显的协同增效作用，抑菌能力得到明显的提高。同时这种协同作用能减少食品中的防腐剂添加量[2]。

目前，以ε－PL和柑橘萃取物为主要成分的抑菌剂已经被成功地研制出来，其中的有效成分能很好地抑制许多致病菌的生长，如Listeria monocytogens、E.coli O－157:H7、Salmonella typhimurium、Vibrio cholerae，Vibrio parahae molyticus、Staphylococcus aur-eaus等，因此，能安全地应用到食品防腐中。除此之外还可以用于卫生消毒、清洗厨卫用品等。

4.2 乳化剂

虽然ε－PL被视为一种天然的防腐剂，但J Hiraki[8]通过研究发现，当ε－PL应用到食品加工过程中会与蛋白质和酸性多糖互相作用，从而导致抗菌活性的降低甚至丢失。ε－PL的乳化能力又较弱，因此，限制了其在淀粉类食品中的应用。Y Ho等研究发现[6]，ε－PL与右旋糖苷通过美拉德反应（Maillard reaction）后所得的产物会有较强的乳化能力，甚至比商用乳化剂（如Sunsoft SE－11和Q－18S）的效果更好，并且此产物的乳化能力在中性pH范围内最强，同时还不受高NaCl浓度（1.0 mol/L）的影响。研究还发现，所得产物中ε－PL的抗菌性几乎完全被保留。因此可见，通过美拉德反应后，ε-PL成为了具有防腐及乳化双重功能的食品添加剂。

4.3 食疗剂

当今肥胖已经成为一种非常严重的问题，它可以引起许多危害人类健康的疾病，比如糖尿病、高血压、动脉硬化等。抑制肥胖产生的有效途径是通过低脂肪饮食来控制；另一种可行方法是在饮食的同时摄入一种纯天然物质，这种物质可以有选择性地来限制肠道对脂肪的吸收。在肠道吸收脂肪的过程中，胰脂肪酶起着很重要的作用，若存在的某种物质能抑制胰脂肪酶活性，就可以有效地控制小肠对油脂的吸收。YKito等[10]首次报道了关于脂肪酶抑制剂活性特征及ε-PL对饭后甘油三脂的抑制作用，指出ε-PL能够作用于含有胆盐和磷酸胆碱的乳剂并使其分解，从而抑制脂肪酶活性。报道中还指出了4种赖氨酸同聚物的50%脂肪酶抑制剂活性（IC50）的大小:ε-PL（222个赖氨酸残基，3.1 μmol/L）＜ε-PL（25～35 个赖氨酸残基，6.8 μmol/L）α-PL（44个赖氨酸残基，7.6 μmol/L）＜α-PL（11 个赖氨酸残基，37 μmol/L）。除 ε-PL 的 IC50与 α-PL（44 个赖氨酸残基，7.6 μmol/L）近似外，可以看出，分子中氨基酸基团数量的多少对ε-PL抑制剂活性起到了重要的作用，而与氨基酸基团在分子中的位置无关。ε-PL与α-PL的不同点在于，ε-PL的抑制活性在经过一系列消化酶，如胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、胃蛋白酶等的作用后依然存在。这些结果表明，ε-PL能在消化道中很好地抑制脂肪的吸收，而其它具有抑制活性的基础蛋白质会因其活性在消化道中的退化而失去作用。Y Kito等进一步以小鼠为研究对象，研究了ε-PL对饭后甘油三脂的抑制作用，在鼠胃中注入15 mg/kg的油脂乳剂和ε-PL，通过2～3 h后试验结果发现，添加了ε-PL小鼠的血浆中甘油三脂的浓度比未添加ε-PL的有明显的降低（p＜0.05）[10]。上述试验结果都证明了一个结论：ε-PL能够通过抑制胰脂肪酶活性来制止小肠对饮食过程中脂肪的吸收，是一种良好的食疗剂。

5 ε-PL研究展望

ε-PL对人体无害，而且可以生物降解。因此，人们已经开始转向研发新的应用领域。例如，ε-PL的氨基基团可以有效地应用于合成超大分子凝胶上，以提高凝胶的吸水性。水凝胶吸水能力很强，可以通过ε-PL与多糖的相互交联而成。合成过程中需要低分子和高分子的交联剂。当藻酸丙二酯与ε-PL混合后，在酯和ε-PL之间发生酰胺化反应，进而生成吸水性很强的水凝胶，其韧性好、易膨胀等特点可以应用于农业、食品和医药等领域。

ε-PL作为抗菌谱广、抗菌性强、安全无毒的天然防腐剂，一定会有巨大的市场需求。但是目前ε-PL生物合成机理还没有被完全探明，严重地阻碍了其发展进程，相信待这个问题解决之后，会有一个更为高效的ε-PL生产体系，其应用前景也将会更为广阔。ε-PL在日本已经开始工业化生产而且应用研究也在不断深入。与国外相比，我国国内的研究水平还停留在实验室阶段，今后研究重点应该是菌种改造和探明生物合成机理，实现产业化，同时加强应用领域的研究，将会明显地提高经济效益和社会效益。

[1]MariyaMarudova,AlistairJMacdougall,StephenGRing.Physicochemical studies of pectin/poly-l-lysine gelation[J].Carbohydrate Research,2004,339:209-216.

[2]Hiraki J.ε-Polylysine,its development and utilization[J].Fine Chem,2000,29:18-25.

[3]Shima S,Matsuoka H,Iwamoto T,et al.Antimicrobial action of ε-poly-L-lysine[J].Antibiot 1984,37:1449-1455.

[4]Fukutome A,Kashima M,Aiuchi M.Acombined chronic toxicity and carcinogenicity study of polylysine powder in rats by peroral dietary administration[J].The Clinical Report,1995,29:1416-1431.

[5]Hiraki J,TIchikawa,Ninomiya S I,et al.Use of ADME studies to confirm the safety of ε-polylysine as a preservative in food[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology,2003,37(2):328-340.

[6]Ho Y,Ishizaki S,Tanaka M.Improving emulsifying activity of ε-polylysine by conjugation with dextran through the maillard reaction[J].Food Chem,2000,68:449-455.

[7]Santini M,Cesare C,Pietro L.Polylysine induces changes in membrane electrical properties of K562 cells [J].Journal of Biomedical Materials Research,1997,35(2):165-174.

[8]Hiraki J.Basic and applied studies on ε-polylysine [J].Antibact Antifungal Agents,1995,23:349-354.

[9]Hiraki J,Ichikawa T,Ninomiya S I,et al.Use of ADME studies to confirm the safety of ε-poly-l-lysine as a preservative in food[J].Regulatory Toxicol Pharm,2003,37:328-340.

[10]Kito Y,Hiramot S,Murao M,et al.ε-Polylysine inhibits pancreatic lipase activity and suppresses postprandial hypertriacylglyceridemia in rats[J].J Nutr,2003,133:1887-1891.