大鼠脑挫伤后HIF-1α表达规律的实验性研究1)

陈国蕾,梁新华,焦 炎

低氧诱导因子(HIF-1)是近年发现的一种重要的缺氧感受因子,由α、β两个亚基组成,其中α既是调节亚基,又是活性亚基。常氧条件下,哺乳动物的中枢神经系统、心 肺、胎盘、骨骼肌和肾等组织内均有HIF-1α的表达,但含量很低,难以检测,但当细胞缺血缺氧时,HIF-1α表达就开始增高,作为转录调节因子,其介导多种效应基因的表达,在缺血缺氧反应过程发挥重要作用[1,2]。本实验旨在通过对脑挫伤后不同时间段HIF-1α的表达进行检测,建立HIF-1α的表达与脑挫伤经过时间的关系,为法医学脑挫伤经过时间的推断提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组 健康成年SD大鼠64只(山西医科大学实验动物中心提供),体重(250±10)g,雌雄不限,随机分为8组,分别为对照组和挫伤后1 h组、4 h组、12 h组、48 h组、72 h组、7 d组、14 d组,每组 8只。

1.2 脑挫伤模型的建立及取材 参照Feeney法建立大鼠闭合性脑挫伤模型。大鼠称重后,3%的戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔麻醉,大鼠脑立体定位仪固定大鼠头部,沿正中线切开头顶部皮肤,在人字缝前方3 mm、颅骨中线旁3 mm处,钻直径5 mm的圆形骨窗。保持硬脑膜完整,在硬脑膜上放置垫片,采用自由落体打击装置,以50 g重锤从20 cm高处垂直下落打击一次,缝合皮肤,术后常规进饮食。分别于伤后1 h、4 h、12 h、48 h、72 h、7 d、14 d颈椎脱臼处死动物,开颅,以脑挫伤灶为中心旁开1 mm行大鼠脑冠状切面取材,置于4%多聚甲醛PBS液中固定,对照组动物直接处死,相同部位取材。

1.3 方法 甲醛中取出组织,常规酒精梯度脱水,石蜡包埋,切片(厚度4 μ m),石蜡切片脱蜡至水,常规行 HE染色,免疫组化SABC法操作步骤参照试剂盒说明书进行,3%H2O2灭活内源性酶,PBS冲洗;微波抗原修复,PBS冲洗;5%小牛血清封闭,一抗稀释度为 1∶100,4℃,过夜,PBS冲洗;二抗37℃,45 min;PBS冲洗;滴加SABC,0.5 h,PBS冲洗;DAB镜下控制显色,水洗,苏木素复染细胞核,脱水,透明,封片。用PBS取代一抗作阴性对照,以细胞核或胞浆出现棕黄色产物为阳性结果。兔HIF-1α IgG多克隆抗体、即用型SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购自武汉博士德公司,其他试剂均为国产分析纯。运用BI-2000图像分析系统,在脑挫伤区周围随机选取5个高倍视野(×200),以损伤部位周围出现棕黄色颗粒为阳性反应,进行阳性细胞计数。

1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行分析。计量资料用均数±标准差(±s)表示,组间差异比较采用t检验和方差分析。

2 结 果

2.1 HE染色结果 对照组神经元细胞形态结构正常,核染色较淡、圆形,核仁清楚;损伤组可见脑实质散在出血,蛛网膜下腔、侧脑室出血。所选切面各部位均可见程度不一的神经元细胞核深染、固缩,神经元细胞水肿,周围出现空隙,逐渐发展为胞核破碎溶解,神经元坏死消失,周围胶质细胞增生。

2.2 HIF-1α免疫组织化学染色 伤后1 h即可观察到阳性反应细胞,呈散在少量分布,阳性产物呈棕黄色,主要位于神经细胞胞核及胞浆内。对照组神经细胞偶见HIF-1α表达。伤后12 h可见表达HIF-1α的神经细胞数增多,表达强度增强,差异有统计学意义(P＜0.05);48 h后达高峰,阳性细胞聚集成簇,周围可见大量棕黄色产物。随后阳性反应细胞逐渐减少,7 d后仍见少量表达,14 d后基本恢复正常。详见表1。组别 n 阳性细胞数

表1 脑挫伤后不同时间段HIF-1α阳性细胞计数(±s)个

表1 脑挫伤后不同时间段HIF-1α阳性细胞计数(±s)个

对照组 8 2.1±1.4 1 h组 8 12.7±2.11)4 h组 8 20.4±2.51)2)12 h组 8 48.8±3.91)2)48 h组 8 109.3±11.51)2)72 h组 8 77.5±4.71)2)7 d组 8 14.8±2.91)2)14 d组 8 3.4±1.42)与对照组比较,1)P＜0.05;与上一组比较,2)P＜0.05

3 讨 论

脑组织细胞对缺血缺氧极为敏感,脑挫伤常会损伤血管神经,破坏脑血循环的调节功能,造成血流变慢,组织缺氧,细胞坏死,引发各种功能障碍。对脑挫伤的调节机制进行研究,发现多种酶、神经递质、细胞因子及相关蛋白在脑挫伤的发展过程中发挥重要作用[3-5]。HIF-1作为一种随氧浓度变化而调节基因表达的转录因子,HIF-1α表达增加是缺血缺氧早期首发的分子水平的适应性反应,它作为调节基因蛋白,可以促进许多效应基因的表达,介导与缺氧有关的各种应激反应[6-8]。国内外很多学者对HIF-1α在脑挫伤的表达机制及调节机制做了深入研究,发现HIF-1α可以诱导其靶基因如促红细胞生成素、糖酵解酶、诱导型一氧化氮合酶和血管内皮生长因子等激活,从而参与氧气运输、能量代谢、血管构建和细胞分化等机体的自我保护反应[9-11]。

本实验通过模拟人的闭合性脑挫伤模型,采用免疫组化的方法对HIF-1α蛋白表达进行观测,结果显示HIF-1α表达主要分布于皮层、海马和脑干,可能与这些部位对缺氧更为敏感有关,在脑挫伤后1 h即可检测到少量 HIF-1α蛋白表达,到 4 h时,HIF-1α蛋白表达开始增强,至48 h达高峰,7 d后仍有少量表达,14 d后恢复正常。苏莉等[12]通过制作弥漫性脑损伤模型对HIF-1α的变化规律进行研究,免疫组化结果发现弥漫性脑损伤后1 h～2 h可在皮质、丘脑和脑干等部位观察到HIF-1α增多,12h达高峰,24h减弱。这与本实验研究结果有一定差异,可能是由于实验方法的不同,形成的损伤程度不同造成的。但两者都表现出先逐渐升高,达到峰值后又逐渐下降的趋势。本次实验结果分析原因可能为:脑挫伤早期,脑组织缺血缺氧所致的氧化应激可以诱导HIF-1α的表达升高,但是由于基因的表达需要经过转录、翻译等过程,所以早期HIF-1α的表达不明显,随着时间的延长,HIF-1α的降解途径阻断以及基因表达持续增加,所以在48 h时达到一个高峰,随后由于组织细胞自我修复以及对缺血缺氧的耐受,HIF-1α的表达逐渐下降直至恢复正常。综上所述,HIF-1α的表达有一定的时间规律性,但是由于损伤程度的差异,单纯通过对其表达量的检测来推断损伤时间是不可靠的,应结合其他的形态学改变,以期得到更为可信的结果。

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