高血压胰岛素抵抗中医证候特点与PTP-1B基因位点IVS6+G82A多态性的相关性研究

蒋卫民,顾 萍,王令谆,赵志英

作为多基因疾病[1],高血压与胰岛素抵抗(IR)密切相关,因此胰岛素抵抗途径也就成为寻找高血压相关基因突变的重要靶点,蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP-1B)作为胰岛素信号转导的负性调节因子,由于其编码异常可以改变基因的表达和功能,PTP-1B基因成为引人注目的研究胰岛素抵抗的靶基因之一[2]。前期已深入研究了高血压患者胰岛素抵抗中医证候特点[3,4],本研究进一步探讨胰岛素抵抗证候特点与PTP-1B基因位点IVS6+G82A多态性的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2006年1月—2007年6月南京中医药大学第一附属医院心内科及南京军区总医院内分泌科门诊及住院治疗的高血压患者116例,其中男62例,年龄40岁～78岁(51.3岁±10.2岁);女54例,年龄49岁～76岁(55.6岁±9.8岁)。高血压诊断标准参照中国高血压防治指南修订委员会2005年制定的《中国高血压防治指南》,所有入选患者均排除继发性高血压、糖尿病。以稳态模式评估方法-HOMA-IR评估胰岛素抵抗,将高血压患者分为伴胰岛素抵抗组(IR组)47例,不伴胰岛素抵抗组(NIR组)69例,同时选取南京中医药大学第一附属医院健康体检人群中腰围女性小于80 cm,男性小于90 cm,且无糖尿病、高血压、肿瘤、肥胖家族史的体检者40名为正常组。

1.2 方法

1.2.1 胰岛素抵抗评估 所有研究对象空腹12 h后,于6:00采静脉血5 mL,以葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FBG),以放免双抗体法测定空腹胰岛素(FINS),采用稳态模式评估方法即HOMA-IR评估胰岛素抵抗,以研究样本背景人群HOMA-IR指数大于第75百分位点作为IR的分割点。

1.2.2 高血压IR中医证候特点评价 参照中华人民共和国卫生部2002年制定的《中药新药临床研究指导原则◦高血压辨证分型标准》进行肝火亢盛或阴虚阳亢型辨证,根据程度无、轻、中、重不同分别记为0分、1分、2分、3分,对以下阳亢主要证候要点进行积分评估:眩晕、头痛头胀、面红目赤、口干口苦、烦躁、心悸失眠、便结溲黄、舌红苔黄,脉弦细而数。

1.3 PTP-1B基因位点IVS6+G82A多态性检测

1.3.1 外周静脉血基因组DNA提取 用Dlass Milk-盐酸胍/异硫氰酸胍方法抽提DNA(Sima公司)。

1.3.2 PTP-1B基因位点IVS6+G82A多态性分析 采取聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法(PCR)扩增,引物分别是F:AGGTCTGGAACCTTCTGTC,B:AACCGGGAGCCAGTTAAAC,反 应 体 系 为 2 ×PCR MasterMix 25 μ L;ddH2O,23.5 μ L;引物 0.5 μ L;DNA 1 μ L;总体积 50 μ L。 反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,共40个循环;终末延伸 72℃ 5 min,PCR产物长度为244bp;反应产物经琼脂凝胶电泳确认后,用限制性内切酶HhaI在37℃条件下酶解PCR产物,2%琼脂凝胶电泳分解酶切产物,紫外灯下观察结果,PCR产物消化后应产生三种基因型:AA型是244bp;AG型是244bp,127bp和117bp;GG型是127bp,117bp。

2 结 果

2.1 PTP-1B基因位点 IVS6+G82A基因型分布(见图 1、图2)116例高血压患者及40名健康体检者PTP-1B基因位点IVS6+G82A基因型分别为AA、AG和GG,等位基因为A和G。

图2 IVS6+G82A多态性内切酶HhaI基因分型

2.2 三组胰岛素抵抗指标及阳亢证候积分比较(见表1)IR组 、NIR组、正常组FBG比较无统计学意义;IR组FINS、HOM A-IR及阳亢证候积分均显著高于NIR组和正常组;而NIR组和正常组比较,FINS、HOMA-IR无统计学意义,但阳亢证候积分显著高于正常组。

表1 三组人群胰岛素抵抗指标及阳亢证候积分比较(±s)

表1 三组人群胰岛素抵抗指标及阳亢证候积分比较(±s)

组别 n FBG(mmol/L)FINS(mU/L)HOMA-IR 阳亢证候积分(分)正常组 40 4.65±1.86 6.35±1.62 2.18±0.95 3.26±1.53 IR组 47 5.42±2.01 9.95±2.201)2) 2.96±1.121)2) 22.73±6.241)2)NIR组 69 4.99±1.73 6.88±1.43 2.36±1.45 18.15±5.121)与正常对照组比较,1)P＜0.05;与NIR组比较,2)P＜0.05

2.3 高血压患者PTP-1B基因位点IVS6+G82A含不同等位基因者IR指标及阳亢证候积分比较(见表2)高血压患者中不含A等位基因者(基因型GG)FBG与含A等位基因者(基因型 AG+AA)比较无统计学意义;但FINS、HOMA-IR及阳亢证候积分均显著高于含A等位基因者。

表2 位点IVS6+G82A不同等位基因携带者胰岛素抵抗指标及阳亢证候积分比较(±s)

表2 位点IVS6+G82A不同等位基因携带者胰岛素抵抗指标及阳亢证候积分比较(±s)

组别 n FBG(mmol/L)FINS(mU/L)HOMA-IR 阳亢证候积分(分)含A等位基因 92 5.02±2.34 7.01±2.54 2.14±1.13 20.13±6.30不A等位基因 24 5.99±1.96 10.43±1.79 3.03±1.47 24.56±7.82 P＞0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

2.4 三组PTP-1B基因位点IVS6+G82A基因型分布频率比较(见表3)GG型频率IR组显著高于正常组和NIR组,而NIR组和正常组比较无统计学意义;AA型频率三组之间比较均无统计学意义;AG型频率IR组显著低于NIR组,但与正常组比较均无统计学意义。

表3 三组PTP-1B基因位点IVS6+G82A基因型分布频率比较 例(%)

3 讨 论

IR是指胰岛素敏感组织和细胞如肝脏、骨骼肌和脂肪细胞等对胰岛素介导的葡萄糖摄取和利用效能降低的一种病理生理状态,IR在高血压中的重要作用已日益得到重视。IR和高胰岛素血症可以出现在许多遗传和非遗传的高血压大鼠中,如自发性高血压大鼠、Dahl盐-敏感大鼠、Milan高血压大鼠等[5-7]。IR发生机制非常复杂,但有证据显示胰岛素和胰岛素受体结合后信号转导异常无疑是其主要机制。

PTP-1B是蛋白酪氨酸磷酸酶家族中的一员,以跨膜受体样蛋白和胞内酶形式存在,催化蛋白质酪氨酸去磷酸化反应,PTP-1B无特异性受体,与不同底物作用可调控不同的细胞信号转导途径,其在胰岛素信号转导方面,一方面通过使胰岛素受体去磷酸化,β亚单位的酪氨酸蛋白激酶(TK)活性受抑制,另一方面通过其底物去磷酸化而降低其与PI3K结合的能力从而阻止胰岛素信号传递,实现胰岛素信号转导途径的负性调节作用,这是胰岛素抵抗发生中的潜在重要因素[8]。PTP-1B基因位于20q13.14/q13.2,为单拷贝基因,全长约74kb,共有10个外显子,开放读码框包括1 305bp,编码453个氨基酸的蛋白,研究发现其基因位于与糖尿病及肥胖相关同一染色体上[9,10]。目前研究已发现PTP-1B一些SNP与胰岛素抵抗相关性疾病如糖尿病、肥胖、血脂异常相关,Bento等[11]研究发现白种人的PTPN1多态性与2型糖尿病易感性显着相关,而非编码区多态性作用更为重要。Santaniemi等[12]在芬兰人(257例2型糖尿病患者,285例非糖尿病者)中发现位点IVS6+G82A突变与糖尿病患者的体重指数及尿微量白蛋白的含量密切相关,同时发现它与糖尿病患者血压可能有关。

胰岛素抵抗是现代医学的一个病理概念,其临床无特异性表现,古代中医对此尚无认识,但因IR是代谢综合征的病理生理基础,是高血压、冠心病、糖尿病等多种疾病滋生的“共同土壤”,其临床表现也多与这类病证相关,因此多属于中医“消渴”“肥满”“头痛”“眩晕”“胸痹”等范畴。IR作为多种疾病所共有的病理生理基础,存在中医病机证候的规律性和基本共性,我们前期研究已证实高血压胰岛素抵抗病机特点之一是在肝肾阴虚基础上所表现出的肝阳(火)亢盛[3,4],本研究进一步探讨了这一基本证候特点的遗传学基础,结果表明高血压胰岛素抵抗患者阳亢证候积分显著高于正常体检者及非胰岛素抵抗高血压患者,表现为肝阳亢盛的证候特点,而胰岛素抵抗患者的PTP-1B基因IVS6+G 82A位点GG基因型频率也明显高于正常体检者及非胰岛素抵抗者,不含 A等位基因者FINS、HOMA-IR及阳亢证候积分显著高于含A等位基因者(AA型+AG型),从而证实PTP-1B基因IVS6+G82A位点G突变与高血压IR肝阳亢盛证候特点具有一定的相关性。由于IR与糖尿病、冠心病、肥胖等均有相关,在高血压人群中发现的这一特点如果能证实在其他胰岛素抵抗相关性疾病中同样存在,将为以清肝泻火为原则治疗此类疾病的中医“异病同治”理论寻找到了部分遗传学证据。

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